乳酸菌 β- 甘露聚糖酶研究

2020-10-16 16:34:19 點擊：

摘要：β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolases,GH）家族，廣泛存在于植物、動物和微生物中，主要水解產物為甘露低聚糖。微生物來源的甘露聚糖酶種類多且活性高，但大部分安全性低，其中乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）甘露聚糖酶具有純化步驟少、易于提取、安全性高等優點，能夠滿足食品級工業生產的需求，因此在保健品、飼料、飲料生產等工業中有重要應用前景。本文介紹了天然LAB甘露聚糖酶的產酶條件、分離純化和酶學特性，簡述了近年來甘露聚糖酶的LAB重組表達及其在果汁澄清和制備益生元MOS方面的應用，為LAB甘露聚糖酶的基礎研究和開發提供參考和依據。

β-甘露聚糖酶（β-1,4-mannan mannao hydrolase,EC.3.2.1.78,以下簡稱甘露聚糖酶）屬于半纖維素水解酶，能夠隨機切割β-1,4-D-甘露糖苷鍵，水解產物為甘露低聚糖（mannanoligo saccharides,MOS）。甘露聚糖酶普遍存在于動、植物及微生物中。微生物甘露聚糖酶種類最為豐富，具有活性高、成本低、提取方便等優點，在食品、飼料、洗滌劑和紡織等工業領域應用廣闊。如細菌中的芽孢桿菌（Bacillus sp.）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）、弧菌（Vibrio sp.）；真菌中的曲霉菌（Aspergillus sp.）、青霉菌（Penicillium sp.）和放線菌中的鏈霉菌（Streptomycete sp.）等菌屬的研究較多。然而常用產酶菌株生物安全性無法滿足食品級領域對高安全性酶日益增長的需求。

乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）作為公認的安全菌株（generally recognized as safe,GRAS），為甘露聚糖酶在保健品和食品等領域中的直接應用提供了安全性保障。近年來，關于LAB甘露聚糖酶的相關研究在不斷探索中，包括產酶條件、酶學性質、分離純化、產酶菌種的篩選、純化以及利用基因工程技術對甘露聚糖酶的異源表達等。本文就目前已報道的LAB作為直接產酶菌株及甘露聚糖酶異源表達菌株的研究進行綜述。

1天然LAB甘露聚糖酶的生產

1.1 產酶菌種及產酶條件

目前已報道的直接產甘露聚糖酶LAB菌株共五株，如表1所示。優化培養基組分和培養條件，是提高產酶水平的有效途徑，常見的方法有單因素、正交試驗和響應面法（response surface methodology,RSM）等。單因素不涉及因素之間的交互作用，正交試驗具有一定的限制性，無法獲得全面可靠的因素和水平組合。RSM是利用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的關系，因此可顯著提高甘露聚糖酶的產量，也是節省成本的重要方法。趙丹等采用RSM對干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HDS-01產甘露聚糖酶的培養基組分及發酵條件進行優化，在葡萄糖12.65g/L、初始pH值5.18的條件下發酵18.23h，酶活力可達81.40U/mL，較優化前提高1.33倍。路氏腸桿菌（Enterobacter ludwigii）MY271的產酶條件經RSM優化后，該菌株在魔芋粉14g/L、Na2HPO40.5g/L和MgSO40.01g/L的條件下發酵培養，酶活力可達到62.76U/mL，是初始酶活力的2.09倍。多數細菌和真菌一般以魔芋粉、瓜爾膠、槐豆膠等多聚糖類作為單一碳源，但L. casei HDS-01是在混合碳源條件下，優先利用葡萄糖進行細胞生長，初始葡萄糖耗盡后，魔芋粉繼而取代并誘導甘露聚糖酶的產生。適宜濃度的葡萄糖既能保證L. casei HDS-01積累足夠的生物量，又不產生葡萄糖抑制效應，而干擾魔芋粉的誘導。細菌產甘露聚糖酶的初始pH值通常為中性或堿性（7.0~9.5），而LAB產甘露聚糖酶的初始pH值在5.0左右，原因在于LAB為嗜酸性的單細胞生物。此外，較真菌而言LAB具有生長速度快，產酶周期短等優點。因此對LAB甘露聚糖酶的研究不僅給工業生產甘露聚糖帶來便利，同時也拓展了人們對LAB糖類代謝能力的認識，也為工業化生產高生物安全性的酶提供了菌種來源。

1.2 乳酸菌甘露聚糖酶的結構特征

1.2.1 分離純化及分子量

LAB甘露聚糖酶多為胞外誘導酶，液體發酵液可通過離心或過濾除去菌體獲得粗酶液。甘露聚糖酶分離純化通常采用硫酸銨分級沉淀法、透析、超濾、離子交換及凝膠過濾等方法。張鑫等使用飽和度65%的硫酸銨沉淀L.casei HDS-01甘露聚糖酶蛋白，以CH3COO－為DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱洗脫陰離子，對甘露聚糖酶蛋白的洗脫效果最好，純化后甘露聚糖酶蛋白含量為4.93mg/mL，純化倍數提高了11.4倍。Nadaroglu等和Adiguzel等分別利用硫酸銨沉淀植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCCR14917TM、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）M17、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）M24和綠色魏斯氏菌（Weissellaviridescens）LB37的甘露聚糖酶蛋白時，飽和度為60%~80%，洗脫陰離子為Cl－，純化效率依次為74.5%、38.2%、75.6%和49.6%。結果表明，同種不同株來源的甘露聚糖酶在溶解度及陰離子相互吸附的能力上存在較大差別。

不同來源的甘露聚糖酶分子量也不盡相同，細菌來源的分子量通常在37~55kDa。環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）NT6.7和尼爾森桿菌（Bacillus nealsonii）甘露聚糖酶的分子量分別為40kDa和50kDa。真菌甘露聚糖酶的分子量一般較高，Chai等報道的綠木霉菌（Trichoderma virens）甘露聚糖酶分子量達到77kDa。LAB甘露聚糖酶的分子量通常為35~55kDa（表1）。L. plantarum M24有兩種甘露聚糖酶組分，分別為36.4kDa和55.3kDa。因此，LAB甘露聚糖酶的分子量與細菌的甘露聚糖酶較為相近，普遍小于真菌的甘露聚糖酶。

1.2.2 酶學特性

1.2.2.1 最適反應pH值

細菌甘露聚糖酶的最適反應pH值通常在略酸性到中性范圍（5.5~7.0）。真菌甘露聚糖酶作用范圍一般偏酸，最適反應pH值為4.0~5.5，如里氏木霉（Trichoderma reesei）甘露聚糖酶的最適pH值為5.5。LAB中，P.acidilactici M17和W.viridescens LB37的甘露聚糖酶最適pH值均為6.0，而L.plantarum M24和L.plantarum ATCC®14917TM甘露聚糖酶的最適pH值分別為8.0和10.0。由此可以看出，LAB甘露聚糖酶的最適反應pH值可以由弱酸性到堿性，與真菌來源的甘露聚糖酶相比，其作用pH值范圍更為寬泛。

1.2.2.2 最適反應溫度

微生物甘露聚糖酶的最適作用溫度為40~65℃。W.viridescens LB37甘露聚糖酶的最適反應溫度為40℃，且該酶在30~70℃時仍保持50%以上的活性。Nadaroglu等測定P.acidilactici M17甘露聚糖酶的最適反應溫度為60℃，L.plantarum M24甘露聚糖酶的最適作用溫度和穩定溫度范圍分別為50℃和30~70℃。L.casei HDS-01甘露聚糖酶酶活最適反應溫度為40℃，然而當溫度升至70℃時，相對酶活下降至30%以下，這是由于高溫環境破壞了α-螺旋結構的氫鍵，導致α-螺旋結構解旋的結果。LAB甘露聚糖酶較為寬泛的作用溫度區間，提升了LAB甘露聚糖酶在工業應用中的潛力。

1.2.2.3 反應熱動力學

微生物甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時，Km值通常為0.5～7.8 mg/mL，如密褐褶菌（Gloeophyllumtrabeum）CBS900.73（Km 3.7 mgmL−1，Vmax 2525 μmolmL−1·min−1）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）HJ14（7.8 mgmL−1，Vmax 270 μmolmL−1·min−1）。LAB甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時，Km值通常為0.01~0.59 mg/mL，如P.acidilactici M17（Km0.592mM，Vmax 78.74 mmolmin−1mg−1）、W.viridescens LB37（Km0.0178 mM, Vmax 82.5 mgmannan mL−1）和L.casei HDS-01（Km2.68 mgmL−1，Vmax400.03 μmolmL−1·min−1）。此外，L.casei HDS-01甘露聚糖酶以瓜爾膠為底物的相對活性比對槐豆膠、果膠和魔芋粉的相對活性高出1~2倍，并且發現瓜爾膠的高親和力和催化效率與其甘露糖和半乳糖較高比例（4：1）的組成是分不開的。

1.2.2.4 激活劑與抑制劑

金屬離子如Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+或Co2+等，對甘露聚糖酶有激活或抑制作用，同種金屬離子對不同來源的甘露聚糖酶產生的影響不同。Ca2+能夠抑制W.viridescens LB37與L.casei HDS-01甘露聚糖酶的活性，卻促進枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilis subsp.inaquosorum）CSB31嗜堿性甘露聚糖酶的活性。Zn2+能夠與P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶的Zn2+結合位點結合，使酶活分別提高4%和286.3%。EDTA是一種金屬螯合劑，可以通過去除金屬離子以使酶失活。EDTA對L.caseiHDS-01甘露聚糖的酶活力有極強的抑制作用，經EDTA作用后剩余酶活僅在15%左右。不同來源的甘露聚糖酶性質存在顯著差異，因此通過改變酶學性質，使甘露聚糖酶達到最佳狀態，進而擴充LAB甘露聚糖酶的應用范疇。

2LAB表達重組甘露聚糖酶

目前，天然LAB甘露聚糖酶的生產方面存在酶產量、酶活及自身穩定性較差等問題，難以滿足工業化應用需求。為了克服這一系列問題，從而更好的將LAB甘露聚糖酶應用于生產實踐，異源表達成為了一種普遍的分子生物學技術，以提高酶產量，降低生產成本，從而獲得安全性高的甘露聚糖酶。異源表達常用的重組表達系統是大腸桿菌（Escherichia coli）和畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統，但P.pastoris表達系統尚未批準用于食品級蛋白表達。E.coli含有內毒素，可能在分泌重組蛋白時釋放，引起人畜的不良反應，導致機體損傷。相比之下，選擇LAB作為異源表達宿主更為安全可靠。

2.1 LAB表達系統

重組蛋白的過量積累可能產生毒素，造成細胞損傷，影響宿主菌的正常生長。此時利用相應的信號肽序列，及時將異源蛋白轉移至胞外，可有效減低這種損傷。鄒業霞等利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）分泌蛋白的信號肽（SPUSP45）構建表達載體，成功實現將短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）甘露聚糖酶基因（manB）在L.casei中的分泌表達，重組酶活可達8.8U/mL，顯示出益生菌和益生元協同調節腸道菌群的潛在能力。Lin等將B.pumilus甘露聚糖酶基因manB克隆到表達載體pELX1上，在L.casei中成功表達。manB基因用于測試L.casei分泌表達時，甘露聚糖酶的穩定性較β-葡萄糖苷酸酶更強，因此manB是比β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）更好的報告基因，開拓了manB基因新的用途。

近年來，L.plantarum也被用作甘露聚糖酶基因的異源表達宿主。在L.plantarum WCFS1中，利用pSIP403載體分泌表達B.circulans NT 6.7的manB基因，重組酶的最適作用pH值和溫度分別為6.0和50℃，重組酶的活力達27U/mL，是原始酶活力的3.29倍，對半乳甘露聚糖具有較高的底物特異性。Sak-Ubol等利用相同體系表達地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DSM13的甘露聚糖酶基因。為避免抗生素標記的使用，將pSIP403表達質粒上的紅霉素抗性基因（eryR）用丙氨酸消旋酶基因（alr）取代，滿足了食品級表達載體選用食品級篩選標記的條件。LAB作為食品級宿主生產重組甘露聚糖酶，在食品、MOS制備及果汁產業等領域中具有廣泛的應用潛力。

2.2 LAB表面展示系統

常規游離甘露聚糖酶的制備過程復雜、穩定性及重復利用率低，這些因素限制了甘露聚糖酶應用的進一步發展。近年來，LAB表面展示技術的迅速發展為甘露聚糖酶的制備提供了新的視角。LAB表面展示可將甘露聚糖酶和LAB的細胞表面蛋白融合表達，使重組甘露聚糖酶固定在LAB細胞表面。在工業生產過程中，LAB表面展示無需復雜的分離純化和固定化等步驟，具有成本低、穩定性高、可重復使用等優點，可用于開發全細胞生物催化劑和生物傳感器等。B.licheniformis DSM13的甘露聚糖酶基因manB與B.subtilis ATCC 23857的殼聚糖酶基因（csnA），分別通過N端脂蛋白錨定和C端細胞壁錨定與L.plantarum的不同錨定位點融合，在L.plantarum WCFS1中成功表達。L.plantarum WCFS1細胞表面展示的甘露聚糖酶活性可達890U/g，經4次循環使用后，重組甘露聚糖酶酶活雖有下降，但仍保持在80%左右，有良好的可重復利用性。Nguyen等將B.licheniformis DSM13的manB基因與L.plantarum的N末端脂蛋白錨定序列融合，將重組甘露聚糖酶展示在L.plantarum WCFS1的細胞表面，細胞表面酶活性達到3500U/g，通過4次循環使用，重組酶酶活仍保持初始酶活的50%左右。采用LAB表面展示甘露聚糖酶，降低發酵生產成本的同時，避免了繁瑣的酶純化步驟，提高了酶的重復利用率，從而拓寬了甘露聚糖酶的應用前景。

3LAB甘露聚糖酶的應用

現階段，甘露聚糖酶在飼料、洗滌劑、紡織、造紙及石油鉆探等行業有重要作用。在飼料工業，甘露聚糖酶具有消除抗營養因子β-D-甘露聚糖的作用，促進畜禽生長，提高飼料利用率。在紡織行業，甘露聚糖酶可使苧麻脫膠徹底，減少纖維素損壞，提升紡織品質。盡管甘露聚糖酶的應用廣泛，但隨著人們對食品級安全問題的日益重視，LAB作為直接產酶來源備受關注，LAB的無毒副作用，為LAB甘露聚糖酶直接應用于醫藥、保健品及果汁飲料等行業提供安全性保障，從而使LAB甘露聚糖酶的地位及熱度也逐年上升?，F已報道的LAB甘露聚糖酶主要應用在果汁澄清和制備益生元MOS兩個方面。

3.1 在果汁澄清中的應用

大部分果汁原料中含有甘露聚糖，導致提取物粘稠度高，增加了果汁加工難度。甘露聚糖酶制劑已廣泛應用于果汁生產，降解甘露聚糖，降低粘稠度，提高出汁率和澄清效果，改善果汁品質和外觀。Nadaroglu等報道了P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶用于橙汁、杏汁、葡萄汁、蘋果汁和桃汁的澄清作用。Adiguzel等利用甘露聚糖酶澄清獼猴桃汁效果最佳，澄清率為117.21%。趙丹等發現L.casei HDS-01甘露聚糖酶用于橙汁的澄清效果較好，澄清率提高到156%。與純酶制劑相比，產甘露聚糖酶的LAB菌株可直接用于果汁加工，既能夠保證食用安全性，還能降低生產成本。

3.2制備益生元MOS

人體及家畜無法直接消化吸收MOS，但MOS在腸道內被雙歧桿菌（Bifido bacterium）、乳酸桿菌（Lacto bacillus）等所利用，促進有益菌的生長，調節腸道的微生態平衡。LAB來源的甘露聚糖酶亦具有制備MOS的能力。B.licheniformis DSM13的manB在異源表達宿主L.plantarum中表達，通過表面展示固定化甘露聚糖酶能夠產生安全、穩定的食品級生物催化劑，將半乳甘露聚糖分解成益生元MOS。Nguyen等成功在L.plantarum WCFS1細胞表面展示重組甘露聚糖酶，將該細菌用作全細胞生物催化劑，以生產益生元MOS。

4結語

隨著對半纖維素資源的開發和功能性低聚糖MOS益生作用的研究，甘露聚糖酶的研究已取得較大程度的進展，在保健品、飼料等行業廣泛應用。LAB作為甘露聚糖酶的直接產酶菌株提供了諸多便利，具有食品安全級的保障和益生作用，符合綠色、經濟、環保的可持續發展理念。為使LAB來源的甘露聚糖酶能夠更廣泛的應用于工業化量產，需提高LAB甘露聚糖酶的環境適應性、酶活力及產酶水平等。LAB甘露聚糖酶的研究將集中在以下幾個方面：第一，挖掘直接產甘露聚糖酶的LAB菌株資源，為酶的食品級應用提供生成菌種；第二，優化產酶條件，為工業化生產提供工藝參數；第三，利用分子生物學手段構建食品級表達系統，提高甘露聚糖酶的安全性及產量。

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