摘要：研究旨在優化淀粉酶、糖化酶和酵母菌固體發酵玉米蛋白粉的條件，以期提高玉米蛋白粉中粗蛋白質的含量。通過單因素及正交試驗，以粗蛋白質含量為指標，確定了玉米蛋白粉的最佳發酵條件。其最適條件為：淀粉酶0.20%、糖化酶0.30%、酵母菌粉0.30%、比例1:0.6，發酵溫度35.0℃，初始pH值5.0~6.0，料層厚度4~6cm，好氧發酵24h后，產物中粗蛋白質含量可達72.35%，提高了20.04%，發酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。

玉米蛋白粉是由玉米粒經濕磨法工藝制得的粗淀粉乳，再經淀粉分離機分離出的蛋白質水，然后用離心機或氣浮懸法濃縮、脫水干燥制得。其蛋白質含量在60%以上，其余約為20%的淀粉和13%的纖維素及少量酯類、玉米黃素、葉黃素等。玉米蛋白質中主要是醇溶蛋白，其含量約占玉米總蛋白的68%，另外還含有22%的谷蛋白及少量球蛋白、白蛋白。

目前國內外學者對玉米蛋白粉的研究多采用酶解法、微生物發酵法或菌酶協同作用法等，以期提高原料中的可吸收性小肽、可溶性蛋白或粗蛋白質的含量，與其他飼料原料搭配飼用，可達到良好的效果。胡海濱等研究了在飼料中添加發酵玉米蛋白粉替代部分魚粉對卵形鯧鲹生長性能的影響，結果表明，在復合飼料中添加11.8%~17.3%的玉米蛋白粉能夠改善卵形鯧鲹的生長性能和飼料利用能力。何嬌嬌等研究了發酵玉米蛋白粉替代魚粉對大黃魚生長、腸道組織結構及腸道微生物菌群的影響，結果表明，大黃魚幼魚飼料中可以使用玉米蛋白粉來替代45%的魚粉，既不影響大黃魚幼魚的生長和存活，也不影響其腸道組織結構及優勢菌群變化。苗國偉對玉米蛋白粉進行了混菌固體發酵的工藝研究，發酵結束后，粗蛋白質含量提高了7.33%，并在肉雞日糧中添加了該發酵玉米蛋白粉，研究結果表明，肉雞平均采食量有所提高，料重比顯著降低，試驗組腸道內大腸桿菌數量顯著減少，乳酸桿菌數量顯著提高，并且明顯增強了肉雞血清對羥自由基（·OH）和超氧自由基（O₂-·）的清除能力。

玉米蛋白粉中存在著部分碳水化合物，如淀粉，不能被動物直接吸收利用，因此限制了其在高品質飼料中的應用。為提高玉米蛋白粉的綜合利用效率，利用微生物學方法，去除原料中的碳水化合物，從而增加其發酵產物中粗蛋白質的含量，使之成為一種優質的植物蛋白資源，在本研究中，采用“復合酶+酵母菌”的方式對玉米蛋白粉進行了固體好氧發酵，并取得了良好的效果，為玉米蛋白粉在畜禽、水產飼料方面的合理、有效利用提供了一種參考方法。

1、材料與方法

1.1試驗材料

飼料用酵母菌粉，活菌數2×101⁰cfu/g。

淀粉酶、糖化酶。

玉米蛋白粉（粗蛋白含量60.27%）。

1.2試驗設計

試驗包括8個單因素試驗和1個正交試驗，分別篩選料水比例（1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8）、淀粉酶添加量（0、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%）、糖化酶添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、酵母菌粉添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、培養溫度（25、30、35、40℃）、培養時間（8、16、24、32、40h）、初始pH值（pH值自然，pH值4.0、5.0、6.0、7.0）、料層厚度（2、4、6、8、10cm），每個因素水平設置3個重復。對于影響結果顯著的淀粉酶、糖化酶粉、酵母菌粉和料水比例再進行四因素三水平L9（34）的正交試驗。

1.3試驗方法

1.3.1單因素試驗

玉米蛋白粉原料200.0g，加入0.40%（與原料的比值，下同）的淀粉酶，0.20%糖化酶，0.20%酵母菌粉，料水比例1:0.7，酶、菌分別溶于水中，攪拌均勻后，同時加入物料中，調整原料起始pH值至5.0~6.0，再將混合均勻的發酵料轉移至鋪有8層無菌紗布的塑料筐內，堆積高度為4~6cm，在表層覆蓋8層無菌紗布，確保四周覆蓋嚴實后，置于恒溫箱內培養，設置發酵溫度為35℃，發酵時間24h。

在上述各單因素恒定的基礎上，對需研究的因素按設計進行調整。

1.3.2正交試驗

在1.3.1得到的各單因素試驗結果中，利用SPSS25.0軟件對各單因素試驗結果進行顯著性分析，得到淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例四個因素對結果的影響較為顯著。由此，設置了四因素三水平L9（34）的正交試驗（見表1）

1.4測定指標及方法

將發酵樣品在80℃下烘干，粉碎后測定含水量、粗蛋白質，以干物質計粗蛋白質含量。將玉米蛋白粉原料和在最適發酵條件下得到的樣品分別進行氨基酸含量的測定。粗蛋白質含量按照GB/T5009.5-2010的方法進行測定；含水量按照GB/T5009.3—2016的方法測定；氨基酸含量按照GB/T18246-2000的方法測定。

1.5數據統計與分析

試驗數據用EXCEL2016進行初步處理后，采用SPSS25.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，檢驗組間差異顯著性，用Duncan's法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，顯著性水平為0.05。

2、結果與討論

2.1單因素試驗結果

2.1.1料水比例(見表2)

水分過低，營養物溶解性減少，底物顆粒膨脹程度低；水分過高，則通透性差，限制氣體和熱量的傳遞。玉米蛋白粉吸水性能強，若水分過少，則原料不能充分吸水膨脹，影響發酵效果；水分過高，原料易出現成團現象，導致氣體難以均衡分布，不能實現均勻發酵，且烘干過程必將增加能耗。由表2及結合產物粗蛋白質含量及實際需求考慮，料水比例宜選擇為1:0.6。

2.1.2淀粉酶添加量(見表3)

利用淀粉酶對淀粉進行酶解處理，能夠充分地去除玉米蛋白粉中殘留的淀粉。由表3可知，添加量為0~0.40%時，粗蛋白質的含量與淀粉酶添加量成正比關系，表明淀粉酶降解了原料中的部分淀粉，使之轉變為酵母可利用的糖元物質，隨著淀粉被消耗，粗蛋白質的含量逐步得到提高。當添加量為0.40%時，繼續添加淀粉酶，粗蛋白質的含量趨于穩定。故宜選擇淀粉酶的添加量為0.40%。

2.1.3糖化酶添加量(見表4)

糖化酶能從淀粉分子的非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖，供酵母生長、代謝利用。其與淀粉酶配合使用，能夠徹底降解原料中殘留的淀粉，從而使粗蛋白質的含量得到進一步的濃縮。由表4可知，糖化酶的添加量宜為0.20%。

2.1.4酵母菌粉添加量(見表5)

發酵料中加入酵母菌粉后，除可利用基質大量合成自身所需要的菌體蛋白和細胞骨架，從而提高飼料中蛋白質含量外，同時還可消耗一定量的糖類物質，釋放出能量和二氧化碳，糖類物質比例降低后，導致了基質中蛋白質的單位含量的增加。在本研究中，玉米蛋白粉未經高溫處理，整個發酵過程中原料均以生料狀態存在，有研究表明玉米蛋白粉生料可經酵母的代謝作用產生酒精。加入的酵母菌能夠利用酶解產生的糖類物質，除生成酒精外，還能夠代謝產生芳香類物質。發酵后的玉米蛋白粉具有濃烈的酵母香味，對畜禽增加食欲，增強消化吸收等有一定作用。由表5結果可知，酵母菌粉的添加量宜選擇0.20%。

2.1.5培養溫度(見表6)

溫度是影響發酵成敗的一個重要因素，在適宜的溫度下，菌株生長代謝活動旺盛，且酶能夠發揮正常功效。如表6所示，25~35℃的溫度范圍內，產物中粗蛋白質的含量隨著溫度的上升呈緩慢增長趨勢。培養溫度高于35℃后，粗蛋白質含量略有下降，故培養溫度選擇35℃左右為宜。

2.1.6培養時間(見表7)

由表7可知，固體好氧發酵初期，粗蛋白質含量增加緩慢，當發酵進行到第24h時，延長發酵時間，粗蛋白質含量趨于穩定。綜合考慮，發酵時間宜選擇24h。

2.1.7初始pH值(見表8)

玉米蛋白粉原料呈酸性，pH值在3.5~3.8之間。由表8可知，當初始pH值為5.0~6.0時，得到的產物粗蛋白質含量最高。原因在于，偏酸性環境下，有利于酵母菌的生長代謝及酶發揮自身活性。故在發酵前，應將玉米蛋白粉原料的初始pH值調至5.0~6.0。

2.1.8料層厚度(見表9)

料層的厚度影響著發酵料的氣體和熱量交換，料層較薄時，表層水分易散失，外層的物料難發酵透徹；料層較厚時，發酵料中心由于微生物呼吸產熱，不能及時散發出去，易形成內部溫度高于設定的培養溫度的情況，進而對發酵結果產生不良的影響。物料厚度低于4cm時，表層物料水分有所散失，有效發酵物料質量偏少，故得到的粗蛋白質含量低；當料層厚度超過6cm后，由于物料中心溫度較高，不適合酵母菌的生長代謝，故發酵能力低。由表9可知，在實驗室研究階段，玉米蛋白粉的厚度選擇4~6cm為宜。在大規模生產中，玉米蛋白粉堆積較厚時，可通過適時翻料，確保內外部氣體和熱量的流通，避免“燒心”現象，實現均勻發酵。

2.2正交試驗結果(見表10~表11)

由表10可知，經過正交表極差分析，各發酵因素對發酵產物中粗蛋白質含量的影響主次順序為B>AC>D，即糖化酶>淀粉酶>酵母菌>料水比例。進一步的方差分析結果由表11可知，四個發酵因素對發酵產物中粗蛋白質的含量沒有顯著影響（P>0.05）。因此，本次試驗中淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例的最佳組合為A1B3C3D1，即淀粉酶添加量0.20%、糖化酶添加量0.30%、酵母菌粉添加量0.30%、料水比例1:0.6，按照該最佳組合進行多次重復試驗，得到的發酵產物中，粗蛋白質的平均含量為72.35%，高于正交試驗中的最佳結果，可作為玉米蛋白粉發酵的最適條件。

2.3發酵前后氨基酸含量的變化

比較玉米蛋白粉原料和經最適發酵條件得到的產物中的氨基酸種類及含量，如表12所示，發酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。在菌酶協同作用的發酵結果中，必需氨基酸中的賴氨酸和纈氨酸含量增加比例較大，分別比發酵前增加了31.30%、28.19%；非必需氨基酸中的組氨酸和絲氨酸分別比發酵前增加了27.13%、23.62%。

3、討論

玉米蛋白粉來源豐富、價格低廉，蛋白質含量高，可達60%以上，但蛋白中醇溶蛋白比高，蛋白質水溶性差、氨基酸組成不平衡。目前對玉米蛋白粉的研究中，主要是利用單一菌種或復合菌種來進行固體發酵。采用羊肚菌對玉米蛋白粉進行固體發酵培養，含水量65%、接種量14%、培養溫度25℃、初始pH值6.0、發酵時間20d，得到蛋白轉化率為22.36%，發酵后親水性氨基酸提高了12.75%。選用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和黑曲霉為復合菌，接種量分別為4%、4%、6%、6%，發酵溫度35℃、發酵時間84h、含水量45%、初始pH值6.0，發酵后，多肽得率為44.03%，粗蛋白質含量提高了15.17%，總必需氨基酸和總氨基酸含量分別增加了12.58%和12.37%。菌酶協同發酵飼料是以國家相關法規允許的飼料原料、酶制劑和微生物，通過發酵工程和酶工程技術協同作用生產的單一飼料和混合飼料。玉米蛋白粉中含有15%~21%的淀粉，通過微生物與復合酶的協同作用，進行一系列的降解與轉化，最終可達到蛋白濃縮的目的。本試驗中，采用酵母菌、淀粉酶和糖化酶混合的協同方式，使玉米蛋白粉中粗蛋白質含量達到72.35%，在原料的基礎上提高了20.04%，高于目前所見固體發酵中相關文獻的報道值。在液體發酵中，雖有粗蛋白質含量高達74.47%的報道，如采用液體發酵的方式處理玉米蛋白粉，玉米蛋白粉4%，pH值6.0，接種量3%，發酵溫度37℃，發酵72h后，蛋白水解度為16.72%，粗蛋白質含量74.47%，但使用液體發酵法處理玉米蛋白粉，受烘干成本高及利潤相對較低等因素制約，并不適用于在中小飼料企業推廣。

目前玉米蛋白粉產品仍存在著醇溶蛋白含量較高、可被動物直接吸收利用的小肽含量相對較低等問題，如何降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白、提高可吸收小肽含量以及驗證發酵后的產物在畜禽、水產方面的飼用效果，將作為下一步的研究重點。

4、結論

經過單因素和正交試驗，得到了玉米蛋白粉的最適發酵條件為：淀粉酶0.20%、糖化酶0.30%，酵母菌粉0.30%、料水比例1:0.6，初始pH值5.0~6.0、發酵溫度35℃，料層厚度為4~6cm，好氧發酵24h。在該條件下得到的發酵產物中，粗蛋白質含量從60.27%提升至72.35%，提高了20.04%，且發酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。

本產品是一種以高濃度乳酸菌和酵母菌等組合酶菌結合的復合專業飼料發酵劑產品，可以發酵我們常見的大部分飼料原料、農家飼料、農產品與食品加工下腳料，制作活性EM菌液與制作青貯飼料，具有發酵、除霉、降解纖維、提高發酵飼料營養與適口性且能夠長時間保存等功能，具有操作簡單成功率高、成本低廉等特點。

活力99增香增甜飼料發酵劑，高濃度乳酸菌、酵母菌專業酶菌結合飼料發酵劑，多功能飼料發酵劑，青貯飼料發酵劑_生態養殖環境治理_生態產品_高效生態養殖技術網 (fjc001.com)

本產品符合飼料衛生標準

【生產許可證號】桂飼添（2021）H01001

【產品執行標準】Q/NNWR 02-2021（飼用復合微生物添加劑Ⅰ）

【適用對象】畜禽、水產、環保

【原料組成】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等，復合酶制劑與載體等。

【產品成分分析保證值】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等合計≥100億cfu/g，水分＜9.0%。

凈重：200 克/袋。

本產品是在活力99生酵劑的基礎上的升級產品，升級了増香增甜等功能效果。

鑒別本產品真假與效果的簡單方法：500毫升左右的礦泉水瓶子中放入約50克大米+300毫升35℃左右的溫水，加入本產品5克，幾個小時就會產生大量香醇氣體，72小時內大米基本溶解為乳狀。做試驗時請切記要注意礦泉水瓶炸開的安全。

產品使用說明書

（一）制作加強型活性EM菌液

在非金屬容器中將本品1包（200克）與1公斤紅糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉類的飼料代替）放入約50公斤溫水中，簡單密封48小時后就變成了加強型活性EM菌液（每毫升活菌在100億左右）。其使用方法如下：

1.在畜禽上的使用方法：根據不同動物與飼養周期按其飼料重量的0.1%-0.5%拌入飼料或飲水中后飼喂或飲用。

2.養殖場緊急除臭生物消毒：取加強型活性EM菌液兌水30倍清水，對產生臭味與異味的養殖區域、糞污水道、糞堆、污水池進行噴灑，以噴灑表面濕潤為準，接待參觀前1-3小時補噴一次效果更好。

3.制作青貯飼料：每噸青貯飼料中加入10公斤加強型活性EM菌液，簡單噴灑在料上壓實密封發酵15天以上。

4.養殖水產上的使用：每畝使用5公斤加強型活性EM菌液進行噴灑，晴天進行噴灑后注意增氧。

（二）制作各種發酵飼料

本品能夠發酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、剩菜剩飯、米糠、統糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黃秸稈、牧草、紅薯藤、輕度霉變飼料等各種廉價飼料（下腳料）、各種飼料原料與全價飼料等，每500公斤待發酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加強型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉類的飼料原料、1公斤食鹽（含有足夠食鹽的原料就不添加），含水量調節到約60%，壓實密封發酵2-7天左右有濃郁香味時即可使用。發酵后飼料的適口性、營養、消化率較未發酵前有明顯提升。發酵后的飼料根據不同動物與不同飼養周期按照10%-50%與該動物其它全價飼料混合后飼喂（先少量飼喂適應后逐漸增加的原則），不可以單獨飼喂或全部飼喂發酵飼料。

（三）發酵水產動物飼料成高濃度乳酸菌保健品

①部分發酵飼料運用：100公斤水產飼料、50公斤清水、本品1包密封發酵7天以上變成高濃度乳酸菌發酵飼料，以10%比例與水產動物飼料混合后飼喂，或者發酵飼料單獨飼喂；②全部發酵飼料飼喂：也叫輕度發酵飼料技術，300公斤水產全價飼料、本品1包、水120公斤混合發酵24小時全部飼喂，這種預消化結合大量乳酸菌飼喂能夠顯著改善水產動物腸道健康、水質改善等優點。

（四）發酵部分禽糞做飼料

發酵雞糞（鴿子糞、兔糞等）作豬、魚等動物飼料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉類的飼料原料、500公斤雞糞，加入適量麥麩或米糠調節含水量約為55%-60%，覆蓋薄膜進行發酵，一周左右有濃郁香味時即可使用，可代替飼料20%左右，用于喂豬或魚類等。

（五）發酵菜粕、棉粕、花生餅、茶枯脫毒

原料1000公斤，玉米面其它含淀粉類的飼料原料100公斤，食鹽2公斤，含水量調節到55%左右，本品2包，簡單地攪拌均勻，密封發酵15天以上成為高濃度乳酸菌小肽豐富的生物蛋白飼料，喂前攤開透氣10分鐘再作為蛋白質原料使用于自配飼料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的發酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。

（六）中草藥及中藥渣發酵方法

1.固態中草藥發酵技術：將50公斤中草藥粉碎，越細越好放入40公斤的35℃左右的溫水中，加入玉米粉與豆粕各5公斤、本品1-2包、食鹽100克，放入塑料容器內壓實密封發酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。

2.液態中草藥發酵技術：1公斤中草藥+1包本品+1公斤紅糖+20公斤清水混合在非金屬容器中簡單密封發酵72小時以上后使用。每噸飼料中添加10公斤或每噸飲水中添加5公斤。

（七）直接拌料或飲水、制粒飼喂、制作水料

根據不同動物在每噸飼料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2噸飲水中使用；本產品采用微生物多層包被技術，在每噸3包本品混合飼料中直接制粒，90℃下5分鐘不會影響效果；動物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全價飼料、1000公斤清水混合后發酵6小時以上后飼喂（預消化的輕度發酵模式），24小時內飼喂完。

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