不同防霉劑對發酵飼料的防霉效果比較
發酵飼料是指一類通過微生物發酵不同原料或混合飼料制成的新型生物飼料。研究表明，發酵飼料可改善動物腸道健康，提高動物產品品質。但由于發酵飼料產品中水分含量較高，在存儲以及使用過程中易發霉變質。霉變不僅會造成飼料適口性以及營養價值下降，造成飼料資源浪費，還會對動物的生長性能和健康造成影響，嚴重時會引起中毒甚至死亡。因此，有必要研究相應措施，以使發酵飼料能夠安全使用，但目前關于發酵飼料類產品的安全保存研究極少。有研究表明，雙乙酸鈉和山梨酸鉀可有效抑制泡菜和腌蘿卜干中霉菌數量的增長，也有相關報道稱，丙酸鈣和檸檬酸在防止飼料霉變方面有良好的效果。為研究不同防霉劑對發酵飼料的防霉效果，本試驗選用市場中常用的幾種防霉劑( 山梨酸鉀、丙酸鈣、檸檬酸、雙乙酸鈉) 添加于發酵飼料中，對不同防霉劑的防霉效果進行比較研究，擬為延長發酵飼料的安全保存期提供技術參考。
1材料與方法
1.1 發酵飼料的制備與防霉試驗
采用南京農業大學動物科技學院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌制備菌液，以8%的添加量將菌液與無抗乳豬配合飼料充分混合均勻，將混合均勻的物料放于密封袋中，排出空氣后封裝，置于37 ℃環境下發酵48 h，即得乳酸菌發酵飼料。
參照相關試驗報道，本試驗首先在發酵飼料中分別加入2. 50%丙酸鈣( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) 、4. 0%檸檬酸( 分析純，上海西隴化工有限公司) 、0. 30%雙乙酸鈉( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) 和0. 25%山梨酸鉀( 分析純，阿拉丁試劑有限公司) ，將上述防霉劑與發酵飼料混勻后，分別取出200 g 置于普通培養皿中，每組4 個重復，將培養皿置于溫度28 ℃、相對濕度為72%的恒溫箱中，分別在第1、2、4、6、8、10、15 和30 天取樣分析; 結果發現，丙酸鈣和雙乙酸鈉的防霉效果最佳。在此基礎上，將0. 10%、0. 20%、0. 30%和0. 50%的雙乙酸鈉以及1. 50%、2. 00%、2. 50%和3. 00%的丙酸鈣加入到發酵飼料中，形成不同梯度的添加量，分別取出200 g 置于非密封條件下，每組4 個平行，置于同樣條件下觀察，對照組不添加任何防霉劑。結果發現，添加2. 00%的丙酸鈣組和0. 30%的雙乙酸鈉組的防霉效果最佳，基于此結果，采集飼料樣品用于pH、乳酸、乳酸菌和霉菌指標的測定。
1.2 測定指標
1.2.1 飼料外觀
分別在試驗開始后第1、2、4、6、8、10、15、30 天觀察飼料的霉變情況，主要包括氣味、結塊情況、霉變情況以及是否生蟲等，并做記錄。
1.2.2 飼料pH 值
用固體pH 計( HI9124N，哈納沃德儀器( 北京) 有限公司) 分別測定試驗第0、1、2、4、6、8、10 天的三組( 對照組、2. 00%丙酸鈣組和0. 30%的雙乙酸鈉組) 發酵飼料pH 值。
1.2.3 飼料中乳酸的含量
分別測定試驗開始后，第0、1、2、4、6、8、10 天三組飼料中乳酸含量的變化。取0. 5 g 飼料樣品，加入4. 5 mL 去離子水，震蕩5 min，靜置一段時間后，取上層清液備用待測。采用乳酸試劑盒( A019－ 2，南京建成生物工程研究所) 測定乳酸濃度。
1.2.4 飼料中乳酸菌和霉菌菌落計數
分別測定試驗第0、1、2、4、6、8、10 天三組飼料中乳酸菌和霉菌含量的變化。將發酵飼料在無菌條件下取出1 g 到離心管中，加入等量的生理鹽水，混勻后梯度稀釋，取稀釋液100 μL 分別在MRS 以及虎紅平板( 奧博星，北京) 上涂板，每組4 個重復，乳酸菌在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，霉菌在28 ℃培養箱中培養72 h。
1.3 統計分析
數據結果以平均值±標準誤( means ± SEM) 的形式表示，數據經Microsoft Excel ( 2010) 初步處理后，利用SPSS 18. 0 進行單因子方差分析，選擇LSD法進行多重比較，顯著性P 值置于0.05。
2結果與分析
2.1 飼料的外觀變化
從表1 可見，不添加防霉劑的對照組中的發酵飼料色澤由正常顏色到變暗，氣味由發酵飼料特有的酸香味到略有油哈味至霉味、濃霉味。對照組在第4 天即出現點狀霉變和油哈味，而添加雙乙酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀的三組的發酵飼料的外觀均無異常，但檸檬酸組出現點狀霉變，而氣味無異常; 第6 天時，對照組出現中度霉變且霉味較明顯，雙乙酸鈉組和丙酸鈣組外觀無異常，檸檬酸組出現點狀霉變且有油哈味，山梨酸鉀組出現點狀霉變但氣味無異常; 第8 天對照組重度霉變且霉味較濃，雙乙酸鈉組和丙酸鈣組出現點狀霉變，但氣味無異常，檸檬酸組組和山梨酸鉀組均出現不同程度的霉變，且霉味較明顯; 試驗結束時，所有組的飼料均出現重度霉變，霉味濃，對照組、雙乙酸鈉組和丙酸鈣組飼料均有蟲變。
2.2 不同劑量雙乙酸鈉和丙酸鈣對發酵飼料防霉效果的影響
從表2 可見，試驗開始后第2 天，對照組與試驗組外觀均無異常; 第4 天對照組出現點狀霉變且有油哈味，S1、S2、S3 組與B1、B2、B3、B4 組外觀均無異常，S1 組出現點狀霉變; 第6 天對照組出現中度霉變且霉味明顯，S1、S2 組與B1、B2、B3 組外觀無異常，S3 組出現點狀霉變，S4 組出現點狀霉變且有油哈味，B4 組出現點狀霉變; 第8 天對照組重度霉變且霉味濃，試驗組均出現不同程度的霉變，第15 至第30 天是所有飼料均出現中度以上霉變。因此可以初步認為雙乙酸鈉和丙酸鈣的最適添加量分別為0. 30%和2. 00%。
2.3 發酵飼料中的乳酸含量
由圖1 可以看出，乳酸含量在試驗開始后第1 天有較小的上升趨勢，而隨著時間延長，乳酸含量整體上呈下降趨勢，在第4 天，雙乙酸鈉組中乳酸的含量顯著高于對照組和丙酸鈣組( P＜0. 05) ，而丙酸鈣組與對照組的乳酸含量差異并不顯著( P＞0. 05) ，這一趨勢持續至試驗進行的第8 天，當保存時間進行至第10 天時，對照組與試驗組的乳酸含量差異均不顯著( P＞0. 05) 。
2.4 發酵飼料的pH 值
圖2 可以看出，隨著保存時間的延長，發酵飼料的pH 值呈明顯的上升趨勢，在試驗開始第0 天至第6 天，分別添加了雙乙酸鈉和丙酸鈣的兩試驗組與對照組相比，差異不顯著( P＞0. 05) ; 在第8 天時，兩試驗組的pH 值均顯著低于對照組( P＜0. 05) ，但兩試驗組之間不存在顯著差異( P＞0. 05) ，這一結果持續至試驗結束。
2.5 發酵飼料乳酸菌菌落計數
由圖3 看出，隨著保存時間延長，乳酸菌數量呈明顯下降趨勢，添加防霉劑后第1 天，對照組和雙乙酸鈉組中乳酸菌數量顯著高于丙酸鈣組( P＜0. 01) ，而隨著保存時間的延長，這一差異逐漸消失( P ＞0. 05) ，在試驗第6 天，添加雙乙酸鈉和丙酸鈣的發酵飼料中乳酸菌的數量顯著高于對照組( P＜0. 01) ，而隨著時間延長這一差異又逐漸消失( P＞0. 05) 。
2.6 發酵飼料中霉菌菌落計數
由圖4 可知，對照組中霉菌數量隨時間延長呈明顯上升趨勢，兩試驗組中霉菌的數量在試驗開始后第6 天時有所增加。在第1 天時，兩試驗組與對照組的霉菌數量無顯著差異( P＞0. 05) ，第2 天時，對照組中霉菌數量明顯升高( P＜0. 05) ，但兩試驗組之間的霉菌數量差異不顯著( P＞0. 05) ; 在第4 天至第10天，兩試驗組中霉菌數量菌均顯著低于對照組( P＜0. 01) ，但兩試驗組之間無顯著差異( P＞0. 05) 。
討 論
研究表明，在原料中水分含量較高的情況下，雙乙酸鈉可進入霉菌細胞內，通過對酶活性的破壞而使霉菌死亡。該結果與閆革華等報道基本一致，其發現雙乙酸鈉對生鮮牛奶的防霉效果要優于其他防霉劑。丙酸鈣已廣泛用于飼料防霉劑，在本研究中所用的四種防霉劑中，其抑菌譜最廣，對大部分真菌和少部分細菌都有很好的抑制作用。洪亦武等的研究表明，丙酸鈣對酵母菌、黑曲霉菌、灰綠曲霉菌和煙曲霉均等十幾種霉菌都有較好的抑制作用。山梨酸鉀在水中溶解度較低，因而可能在發酵飼料中難以發揮更好的防霉作用; 檸檬酸發揮防霉抑菌作用主要是依靠降低環境pH 來實現，由于本試驗所用發酵飼料的pH 較低，所以檸檬酸難以發揮其酸性防霉效應。試驗結果表明， 添加量為0. 30% 的雙乙酸鈉和2. 00%的丙酸鈣防霉效果最佳，其原因可能與幾種防霉劑的作用機制不同有關。
本試驗中，乳酸濃度在第0 至第1 天時有緩慢增長，這可能是由于發酵飼料中仍有部分乳酸菌產生少量乳酸。隨著試驗時間繼續延長，乳酸菌的大量死亡，在第2 天時乳酸含量開始緩慢下降。在保存至第4 天時，雙乙酸鈉組乳酸含量顯著高于丙酸鈣組和對照組，暗示雙乙酸鈉組中的酸性物質減少量少于丙酸鈣組和對照組，這可能與雙乙酸鈉的防霉機理有關。雙乙酸鈉主要依靠游離出的乙酸分子破壞細胞內的酶系統來抑制微生物的活性，游離的乙酸也可以有效降低飼料的pH，這與雙乙酸鈉組的pH 值一直低于其他兩組吻合。在本試驗中，固態發酵飼料的pH 在發酵結束后的第2 天開始緩慢升高，并在第10 天達到7 左右，這意味著發酵飼料中的乳酸和揮發性脂肪酸等酸性物質已經幾乎消耗殆盡，這一結果與Wang等研究結果相一致。Missotten 等的研究表明，乳酸菌發酵液體飼料的pH 會在達到穩定之后緩慢上升，這是由于飼料中菌體的大量死亡裂解，釋放了大量的菌體蛋白，并且飼料中的某些微生物開始利用有機酸和菌體蛋白產生大量含有堿基的代謝產物，這些物質會導致pH 的上升。
黃通旺研究表明，在普通飼料中添加0. 1%的雙乙酸鈉可有效抑制飼料中霉菌的生長，且作用時間可以持續40 天左右。在本試驗中，雙乙酸鈉和丙酸鈣均可以有效抑制霉菌至第4 天，至第6 天以后飼料中霉菌數量超出限量標準，而對照組的霉菌數量在第3 天就已經超出限量標準。與黃通旺研究結果不一致的原因可能是飼料性質不同、保存條件不同，發酵飼料由于水分含量高，并且在本試驗中暴露于空氣中，霉菌更容易大量生長; 而石傳林等在用雙乙酸鈉作為青貯飼料防霉劑時發現，添加雙乙酸鈉的青貯玉米秸質地松軟，顏色黃綠、腐爛少，霉菌計數結果顯示比對照組顯著降低，這與本試驗結果相一致。
考慮到發酵飼料的主要活性功能物質包括乳酸菌等活菌制劑及微生物代謝產物，因此，本實驗同時研究了防霉劑對發酵飼料中乳酸菌數量的影響，據Heres 等報道，在不經過特殊處理條件下，乳酸菌液態發酵飼料中乳酸菌的數量在發酵結束后5 d 內開始大量死亡; Hansen 等也發現，在液體發酵飼料中乳酸菌的對數生長期出現在12 ～ 24 h，在進入穩定期后24 h 菌體開始裂解并釋放大量菌體蛋白。在本試驗中，添加雙乙酸鈉和丙酸鈣以及對照組的發酵飼料中乳酸菌數量總體都呈明顯下降趨勢，與前人的研究結果一致。而丙酸鈣的抑菌作用相對較強，乳酸菌的繁殖在本試驗的開始即受到抑制，從這一點來看，雙乙酸鈉的防霉效果要優于丙酸鈣。試驗同時發現，隨著保存時間的延長，添加雙乙酸鈉和丙酸鈣的兩組發酵飼料中乳酸菌的數量明顯高于對照組，可能是兩種防霉劑抑制了霉菌的大量增殖，飼料中的營養物質依然可以被乳酸菌利用進而生長，而對照組中，乳酸菌數量呈明顯下降趨勢，說明霉菌在大量繁殖的過程中可能競爭性的抑制乳酸菌的生長。
4結 論
在非密封狀態下的乳酸菌發酵飼料中添加雙乙酸鈉和丙酸鈣的防霉效果優于山梨酸鉀和檸檬酸; 其中，添加2. 00%的丙酸鈣和0. 30%的雙乙酸鈉可達到最佳防霉效果。綜合考慮所用添加劑的成本及添加劑量等因素，本實驗發現，以雙乙酸鈉添加量為0. 30%，保存時間不超過6 d 最為經濟適用。
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