蛋白質水解物在動物營養中的作用
蛋白質是一種大分子物質，通常由二十種不同的氨基酸通過肽鍵連接組成。蛋白質是動物組織（如骨骼肌、乳腺、肝臟和小腸）和畜產品（如肉、牛奶、雞蛋和羊毛）的重要組成成分。例如，生長期肉牛和育肥豬骨骼肌中的蛋白質含量約占干物質總量的70%（Wu等，2016）。因此，攝入充足的蛋白質對家畜、家禽和魚類發揮最大生長、生產性能和飼料效率都是必不可少的。Wu（2013）報道，飼料中的蛋白質（如血粉、肉、骨粉、腸黏膜粉、豆粕、花生粕、棉籽粕）在小腸中蛋白酶的作用下被水解成小肽（二肽、三肽）和游離氨基酸。水解生成小肽的類型與動物生理狀況和日糧組成密切相關。動物和植物性蛋白質飼料在被采食前通過化學處理、酶或者微生物發酵，可改善其營養品質、降低抗營養因子的含量并產生肽類（Dieterich等，2014；Pasupuleki等，2010）。此外，酶解和微生物發酵可以提高動物和植物性蛋白質飼料中小肽的溶解度、黏度、乳化性和凝膠化程度。
不同來源（細菌、植物和酵母）的蛋白酶均可用來酶解動物和植物性蛋白質飼料，多種微生物通過發酵，將動物或植物性蛋白質飼料水解生成肽類。目前，蛋白質水解物已廣泛應用于醫學、營養（包括動物營養）和生物技術領域（Pasupuleki等，2010）。本文主要對通過酶解技術和微生物發酵技術生成蛋白質水解物的相關研究進行綜述，并對其在動物飼養中營養及生理學功能進行探討。
氨基酸是含有氨基和酸基基團的有機物。除甘氨酸外，所有蛋白源氨基酸均有一個α-氨基，并可在動物體內和飼料中形成L-異構體。肽被定義為由2個或2個以上氨基酸殘基通過肽鍵連接成的有機分子（Wu，2013），每形成一個肽鍵脫去一分子水。寡肽由2～20個氨基酸殘基組成。含有小于或等于10個氨基酸殘基的寡肽稱作小寡肽（或簡單的小肽），而含有10～20個氨基酸殘基的寡肽稱為大寡肽。Kyte（2006）認為，超過20個氨基酸殘基組成的肽被稱為多肽。蛋白質是一種高分子量的多肽，通過肽鍵將相鄰氨基酸分子的α-氨基和α-羧基連接。 通過分子質量大小可區分多肽和蛋白質。Kyte（2006）認為，分子質量大于或等于8000Da的多肽（即≥72個氨基酸）被稱為蛋白質。例如，泛素（含72個氨基酸的單鏈）和酪蛋白α-S1（含200個氨基酸）稱為蛋白質，而胰高血糖素（含有29個氨基酸）和催產素（9個氨基酸）稱為肽。然而通過分子質量大小區分多肽和蛋白質的方法并不是絕對的。例如，胰島素[51個氨基酸（A鏈含20個氨基酸和B鏈含31個氨基酸）]具有典型的蛋白質3級結構，因此被公認為一種蛋白質。而從豬小腸黏膜中分離得到的PEC-60（含60個氨基酸的單鏈）（Agerberth等，1989）和dopuin（含62個氨基酸的單鏈）（Chen等，1997）被稱為多肽。三氯乙酸（TCA，終濃度5%）或高氯酸（PCA，終濃度0.2M）可完全沉淀動物組織、細胞、血漿和其他體液（例如，瘤胃、尿囊、羊膜、腸腔液和食糜）（Rajalingam等，2009）中的蛋白質。同樣，乙醇（終濃度為80%）也可以有效地沉淀水溶液中的蛋白質和核酸（Wilcockson1975）。這種方法可以有效去除蛋白質水解物中的水溶性無機化合物（如鋁鹽化合物）。 蛋白質在酶、微生物、酸、堿作用下可產生蛋白質水解產物。工業上生成蛋白質水解物常用的蛋白源包括動物性蛋白質（如酪蛋白、乳清蛋白、肉類）和植物性蛋白（如小麥、水稻、大豆、豌豆和棉籽等）（Dieterich等，2014；Pasupuleki等，2010；Pasupuleki等，2010）。蛋白質水解的方法不同，水解時間也從1～100h不等。酶或微生物水解過程中添加抑菌或殺菌防腐劑（如苯甲酸）可延長其水解時間，通過加熱可使酶失活從而終止水解反應。水解結束后，可通過離心、過濾或微過濾系統分離蛋白質水解物中的不溶性物質。多次過濾后可獲得預期的透明清晰的水解溶液。必要時可通過炭粉進行脫色并除去溶液中的混濁物質。若需要除去水解產物中的鹽，可將濾液進一步通過交換色譜，除去水解物中多余的鹽。蛋白質水解產物中的微生物可以通過熱處理（巴氏殺菌）的方法消除。最后，將蛋白質水解物進行干燥、包裝，形成產品。 蛋白質水解產物包括游離氨基酸、小肽和大肽，且其比例隨著蛋白質來源，水解過程中的水份含量、蛋白酶類型和微生物種類的不同而不同。水解度，即蛋白質被水解的程度，可通過裂解的肽鍵數目除以蛋白質中的總肽鍵數目，并乘以100計算的得到。肽鍵裂解數等于游離氨基酸的摩爾數加上PCA或TCA可溶性多肽的摩爾數。蛋白質水解產生的肽缺乏統一的標準樣，因此定量動物、植物、微生物來源的多肽具有很大的技術挑戰性。游離或肽鍵結合形式氨基酸的百分比含量計算方法如下： 游離氨基酸百分比/%=游離氨基酸含量／蛋白總氨基酸含量×100； 多肽氨基酸百分比/%=多肽氨基酸含量／蛋白總氨基酸含量×100； 由于氨基酸的分解程度有限（如酶解），因此多肽的百分比含量/%=（蛋白質總氨基酸含量-自由氨基酸含量）/蛋白質總氨基酸含量×100。高效液相色譜法被廣泛應用于測定游離氨基酸含量。高效液相色譜法和其他分析技術（如核磁共振、質譜、飛行時間質譜、肽圖譜和離子交換色譜法）常被用來測定蛋白質水解物中多肽的含量（Sapan等，2015；McGrath等，1972）。 2.1 蛋白質的酸水解 1920年法國化學家Braconnot首先報道了在高溫下進行蛋白質（明膠）酸水解的方法。在110℃條件下，6mol/LHCl作用24h可將蛋白質完全水解（Dai等，2014）。相同溫度條件下用鹽酸作用2～6h可將蛋白質水解成多肽。酸水解后將產物蒸發、巴氏殺菌并噴霧干燥。大部分蛋白質酸水解產物用作增味劑（例如，水解植物蛋白調味劑），且蛋白質的酸水解成本低。然而，蛋白質在酸水解過程中色氨酸結構被完全破壞，部分蛋氨酸受到損失，同時將谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉化為谷氨酸和天冬氨酸（Pasupuleki等，2010）。 2.2 蛋白質的堿水解 強堿，如4M氫氧化鈣、氫氧化鈉或氫氧化鉀等堿水解劑在高溫下（如105℃）反應20h可將蛋白質完全水解（Dai等，2014；McGrath，1972）。食品工業生產中常用低溫（例如，27～55℃）和短時間（如4～8h）水解蛋白質產生多肽。堿水解產物經蒸發、巴氏殺菌并噴霧干燥，最后形成產品。與酸水解一樣，蛋白質堿水解的成本也很低，并且不破壞色氨酸。然而，堿水解可破壞大多數氨基酸的結構。因此，堿性水解法通常用于生產發泡劑（如雞蛋蛋白質的替代物）和泡沫滅火器，而很少應用于食品工業中。 2.3 蛋白酶水解 許多不同種類的蛋白酶均可將肽鍵裂解，根據反應類型的不同可將蛋白酶分為外肽酶（在蛋白質末端水解肽鍵）和內肽酶（在蛋白質內部水解肽鍵）。一些蛋白酶（二肽酶）可水解二肽，而其他的蛋白酶則將蛋白質末端（取代、環化或異肽鍵相連的）氨基酸殘基移除（即肽鍵以外的αα-氨基-羧基；如ω-肽酶）。當蛋白酶對特定氨基酸肽鍵有明顯的偏好性時，可以以其偏好的氨基酸對酶進行命名（如亮氨酸氨基肽酶、脯氨酸外肽酶）。相反，一些酶具有非常廣泛的特異性，可用字母數字命名（例如，肽基二肽酶A，肽基二肽酶B，二肽酶I和二肽酶II）。一部分蛋白酶同時含有外肽酶和內肽酶的性質（例如，組織蛋白酶B和H）。酶法水解蛋白質需要的條件相對溫和（例如，pH6～8，30～60℃），可最大限度地減少水解過程中對蛋白質、氨基酸的破壞等副作用。 大部分用于生產水解蛋白質產物的酶來源于動物、植物和微生物（表1）。動物源酶（特別是豬源酶）包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、羧基肽酶和氨肽酶；植物源酶包括木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶；不同細菌和真菌來源的酶其反應溫度、pH和離子濃度條件差異大，具有較廣泛的選擇范圍（Kunst，2003；Dixon，1979）。商業化的酶可以是粗產品，或是經過半純化、純化的酶。單一酶（例如，胰蛋白酶）或多種酶混合（例如，鏈霉蛋白酶、胃蛋白酶和脯氨酸肽酶的混合物）均可水解蛋白質。酶的選擇取決于蛋白質的種類和需要的水解程度。例如，水解含有較多疏水性氨基酸的蛋白質，需優先選擇可裂解氨基酸肽鍵的酶。通常將蛋白質水解產物中特定的肽分離出來或除去意外的肽。某些蛋白質的水解（如木瓜蛋白酶水解大豆蛋白與酪蛋白18h）可以生成疏水性肽和苦味氨基酸（Kim等，2003）。蛋白水解過程中添加勻漿的豬腎皮質或活性炭可以減少苦味肽產生。與酸或堿水解蛋白過程相比，酶水解的主要優點是：（1）水解條件（如溫度和pH值）溫和，不會造成任何氨基酸的損失；（2）蛋白酶能特定并精確控制肽鍵水解的程度；（3）水解后可加熱使酶失活（例如，85℃，3min），便于蛋白質水解產物的分離。1氨基酸、肽和蛋白質的定義
2蛋白質水解物
2.4 微生物發酵
微生物產生的蛋白酶可將細胞外蛋白質水解為大肽、小肽和游離氨基酸。小肽可進一步被微生物攝取并在細胞內水解，產生游離的氨基酸。微生物也可產生能同時分解碳水化合物和脂類的酶（Smid等，2013）。蛋白質發酵可分為液態發酵和固態發酵。液態發酵在高水分條件下進行，而固體發酵在低水分條件下進行，并可減少蛋白質水解物的干燥時間。
醬油是最早的微生物發酵產品。用于生產醬油的原料為煮熟的黃豆、烘烤過的谷物、鹽和米曲霉或曲霉（一種真菌屬）。在Koji發酵法，等量的大豆和小麥與曲霉、醬油曲霉、釀酒酵母和細菌（芽孢桿菌和乳酸桿菌）共培養用于發酵生產醬油。在過去的二十年中，許多微生物已被用于水解植物源蛋白質，如乳桿菌BGT10和乳酸桿菌LMG17315用于水解豌豆蛋白質；納豆芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌以及真菌、米曲霉或曲霉用于水解大豆蛋白質（Bah等，2016；Li-Chan，2015；López-Barrios等，2014）。乳酸菌（如乳桿菌和乳球菌）通常用于發酵乳制品。發酵的主要優點在于微生物不僅可以將蛋白質分解為多肽和游離氨基酸，還能去除超過敏或抗營養因子（如胰蛋白酶抑制劑、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、植酸、寡糖棉子糖和水蘇糖、皂甙大豆）。
生物活性肽是蛋白質中除具有一定營養價值外還具有生物學功能的氨基酸片段（López-Barrios等，2014）。其有抗菌、抗氧化、抗高血壓和免疫調節作用。這些生物活性肽通常為2～20個氨基酸，但有些可能含有20個以上的氨基酸。許多生物活性肽具有共同的結構特性，如氨基酸含量少，疏水性氨基酸含量多，含精氨酸、賴氨酸和脯氨酸殘基。在動物中，內源性肽發揮重要的生理或調節功能。例如，PEC-60能激活小腸和其他組織中的Na/KATP酶。此外，小腸中的潘氏細胞能夠分泌多種具有抗菌作用活性肽（Bevins等，2011）。大腦釋放大量的肽可用于調節動物內分泌、采食量和行為活動（Engel等，2014）。 Zhanghi等（2010）報道，肽轉運蛋白1（PepT1）可將二肽和三肽通過腸上皮細胞的頂膜運輸進入細胞。然而，由于小腸內含有肽酶，因此不可能將腸腔中大量的營養性功能肽輸送入門靜脈或淋巴循環系統。食物來源的肽可以在小腸中發揮生物活性（例如，生理調節）并將信號傳輸到大腦、內分泌系統和免疫系統，從而對全身產生有益的影響。 Mellander（1950）報道，酪蛋白是第一個被發現的可產生生物活性肽的蛋白質，該活性肽可通過維生素D依賴性信號促進佝僂病嬰兒骨的鈣化和生長。到目前為止，許多血管緊張素I轉換酶抑制肽是從牛奶或肉類中產生的（表2）。血管緊張素I碳末端的組氨酸-亮氨酸二肽被血管緊張素I轉換酶移除形成血管緊張素II（一種強有力的血管收縮肽），從而發揮抗高血壓作用（Ryan等，2011）。常用的血管緊張素轉換酶抑制肽藥物有IleProPro（IPP）和ValProPro（VPP），兩者都來源于乳蛋白（Power等，2013）。Martínez-Augustin等（2014）研究表明，這兩種肽可能不會被胃腸道完全水解，未被水解的肽可穿過腸上皮細胞被運送到血液中。同樣，肉類（Ryder等，2016）和蛋黃中的蛋白質水解產物（Zambrowicz等，2015）也能產生有活性的血管緊張素轉換酶抑制劑。 動物源（如魚和肉）（表3）或植物源蛋白質飼料水解產物中的某些小肽通過清除自由基、抑制氧化物質的生成、或抑制炎性細胞因子的產生來發揮抗氧化功能（Bah等，2016；Power等，2013；Memarpoor-Yazdia等，2012；Shimizu等，2007）。許多生物活性肽具有血管緊張素I轉換酶抑制作用和抗氧化作用。另有報道指出，動物和植物蛋白質水解物中的某些肽（表4）與小腸內源性抗菌肽一樣，有抗菌作用。這些抗菌肽可能通過破壞細菌的細胞膜，干擾細胞內蛋白質的功能，引起胞漿蛋白質聚集從而發揮抗菌作用（Osman等，2016；Lima等，2015；Wald等，2015），但潛在的作用機制還不清楚。此外，某些蛋白質，例如酪蛋白、面筋（存在與小麥、黑麥和大麥中）和大豆蛋白質在胃腸道內經水解可產生寡肽（通常為4～8個氨基酸）（Froetschel，1996），其能與大腦中的阿片樣受體結合從而影響動物腸道功能、采食量和行為（表5）。3蛋白質水解產生的生物活性肽
3.1 動植物蛋白水解物在動物營養中的應用
Wu等（2014）報道，畜牧業的一個主要目標是提高牛奶、肉和蛋生產過程中的飼料利用效率，這就需要為小腸消化和吸收營養物質提供最佳的條件。到目前為止，植物和動物蛋白質水解產生的肽被廣泛用于生產豬、家禽、魚和寵物飼料，它們的應用能經濟有效地提高動物生長和生產性能及腸道健康（McCalla等，2010）。其發揮作用的可能機制是：
（1）小腸對小肽的吸收效率高于等量的游離氨基酸；
（2）小腸中細菌對小肽的分解代謝率要低于等量的游離氨基酸；
（3）相對于單個的氨基酸，小肽能通過腸道運輸多種氨基酸進入靜脈，使血液中氨基酸更平衡；
（4）與等量的游離氨基酸相比，特定的肽能夠改善胃腸道的形態和功能，比如分泌、蠕動以及抗炎反應。
在豬營養研究中，多肽功能相關的研究主要集中于斷奶仔豬階段，多肽能夠提高仔豬的適口性，促進生長，提高飼料轉化效率和健康狀況（Kim等，2010；Stein，2002；Kim等，2000；Lindemann等，2000；Zimmerman，1996）。這主要由于幼齡動物的消化和免疫系統不成熟，斷奶后經常出現采食量降低，腸黏膜萎縮、腹瀉和生長發育受阻等。此外，已經有商業化多肽產品應用到犢牛（Lalles等，1995），家禽（Opheim等，2016；Frikha等，2014），魚類（Khosravi等，2015；Refstie等，2005）和寵物（Nagodawithana等，2010）飼料中，其能改善動物的營養狀況，腸道功能以及抗病能力。
3.2 植物多肽
植物性蛋白質往往含有致敏蛋白和抗營養因子，幼齡動物和寵物飼料中含有這些物質往往會降低植物蛋白的營養價值。例如，大豆可以加工制成大豆粉和大豆蛋白濃縮物，以消除一部分抗營養物質。然而豆制品中仍然含有大量蛋白質類型的過敏原（如大豆球蛋白和β-大豆蛋白）和胰蛋白酶抑制劑、外源凝集素（血凝素）、植酸、大豆低聚糖（棉子糖和水蘇糖）和甾體苷（大豆皂苷）。已有報道指出，利用微生物（如霉菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌）發酵大豆可提高斷奶仔豬生長性能和飼料利用率。3～7周齡仔豬日糧中添加3%～6%大豆粉（玉米和大豆為基礎日糧），其生長率與添加相同比例脫脂奶粉仔豬的生長率不相上下。同樣的，以玉米和大豆為基礎飼料的3～7周齡豬日糧中添加4.9%發酵的大豆粉可以代替3.7%噴霧干燥的血漿蛋白，并且不降低豬生長性能或者飼料轉化率。大西洋鮭魚飼喂含40%發酵大豆白片，也得到了相似的結果。而在紅鯛幼魚的日糧中，50%魚料可以被替換成相同比例的大豆蛋白質水解物。考慮到魚粉在世界各地變得越來越稀缺，飼料中添加植物蛋白水解物對于水產養殖的發展十分重要。此外，大豆分離蛋白（占日糧19.7%）水解物可作為昂貴的脫脂奶粉的替代品被用于維持幼牛的高生長性能。酸性植物蛋白質水解物（如麥麩含有大量的谷氨酰胺和谷氨酸）通常稱為水解植物蛋白，因其中含有豐富的谷氨酰胺，因此在寵物飼料中添加1%～2%可提高飼料適口性。
3.3 動物多肽
斷奶仔豬日糧中添加6%噴霧干燥的小腸水解產物（SDPI；肝素生產的副產品），飼喂兩周后發現，仔豬的生產性能要優于飼喂添加血漿蛋白粉基礎日糧組、及添加乳清粉基礎日糧仔豬。哺乳仔豬補飼小腸水解產物SDPI，可使仔豬在斷奶后3～5周表現出更好的生長性能，這可能是由于仔豬腸絨毛面積增加了，營養物質被更好的消化和吸收。與此相類似，Stein（2002）報道指出，給斷奶仔豬（20日齡斷奶）飼料中添加1.5%、3%或4.5%SDPI比添加相同含量魚粉的仔豬，有更好的生長性能和飼料轉化效率。并且SDPI的作用呈劑量依賴性。此外，給斷奶仔豬飼喂含6%酶蛋白水解產物（來自豬血液和選定家禽組織混合物），其生長性能和飼料轉化效率與飼喂含有相同比例噴霧干燥血細胞日糧的仔豬相近。同樣地，在玉米和大豆粉為基礎的日糧中，添加2.5%、5%或者7.5%的水解豬黏膜蛋白，能夠增加生長雛雞的日增重以及提高其營養水平。另外，采食含5%的大西洋鮭魚蛋白質水解物（來自內臟）的雞其生長性能優于采食含或不含4%的魚食日糧的雞。日糧中魚副產品蛋白水解物的添加（10%）能夠促進歐洲幼鱸魚的生長和腸道發育、免疫性能，并提高其在鰻弧菌（一種革蘭氏陰性菌）感染下的存活率（Kotzamanis等，2007）。因此，SDPI和其他動物蛋白質水解物在動物生產中具有良好的應用前景。
植物和動物蛋白質水解物能夠產生易消化的多肽、生物活性肽以及特定的氨基酸（如谷氨酸），其能為動物提供了一定的營養、生理或者調節作用。這些蛋白質水解物的工業生產方法包括： （1）強酸或強堿法； （2）溫和的酶促反應； （3）微生物發酵。 水解度通過蛋白質中肽鍵斷裂的數目除以蛋白質總的肽鍵數目來計算。化學水解通常用來產生香味，而微生物發酵不僅能產生肽也能去除蛋白質成分中的抗營養因子。除了提供氨基酸的營養價值以外，生物活性肽還具有抗菌、抗氧化、抗高血壓和免疫調節作用。這些肽能有效改善動物腸道形態、功能并提高動物（包括豬、仔牛、雞、寵物和魚）對多種感染性疾病的抵抗能力，進一步提高生長性能和飼料轉化率，改善動物健康狀況。將動物副產品或植物性飼料轉化為優質蛋白質水解物后用于飼喂家畜、家禽和魚類是一種非常經濟有效的方式。4小 結
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