纖維素分解菌與乳酸菌復合發酵條件的響應曲面優化分析
響應曲面優化法(response surface methodology,RSM)是一種實驗條件優化的方法,適宜解決各類非線性數據處理的相關問題。其主要優勢在于可對實驗水平進行連續的分析,而不是僅對孤立的實驗點進行,所以具有普通正交實驗方法無法比擬的優越性。且此方法因研究的關系簡單(各因子間、因子與響應值間)、省時準確等,所以常被認為是降低開發成本、優化加工條件、解決生產過程中實際問題的一種最為有效的方法,已被廣泛地應用于各個領域。當前,采用響應曲面分析法主要是對發酵工藝參數和條件等進行優化,而少見利用此方法優化青貯玉米外源添加菌種量和比例的相關研究。
青貯玉米原料附著多種微生物,其中有益微生物主要為同型或異性發酵乳酸菌,有害微生物多以真菌為主。也有研究表明,某些真菌作為青貯添加劑添加,其不僅不會破壞原有的發酵過程,且可有效降低發酵底物的纖維素含量。其中黑曲霉(Aspergillus niger)作為我國農業部和美國FDA 認證的安全菌種,可產生活性較高的多種胞外酶,適合飼用復合酶的固體發酵。綠色木霉(Trichoderma viride)作為自然界中普遍存在的真菌,其不但可以產生多種具有生物活性的酶系,且對植物病理生物防治具有重要的作用。此外,某些細菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產菌,具有抑制大腸桿菌、沙門氏菌生長,以及對植物病原真菌的溶菌等作用。此外,上述菌種產生的酶系(糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶等多種胞外酶)可將發酵底物中的多糖降解為寡糖和單糖,一方面可為菌體生長提供豐富的營養底物,另一方面對于青貯原料,可顯著降低發酵體系內銨態氮和總氮的比值、中/酸性洗滌纖維含量、丁酸與總酸的比值,并大幅抑制了青貯有害微生物的生長。以往諸多研究均表明,酶系是否在青貯中發揮作用既要控制青貯發酵的環境,也要充分考慮發酵菌種間的協同性。因此控制這些微生物的合理繁殖是調制優質青貯的重要前提之一。鑒于此,本研究擬采用響應曲面法,探究外源添加劑同、異型發酵乳酸菌和纖維素分解菌菌群(黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌)復合發酵的理論最佳發酵比例和劑量,為青貯玉米發酵提質降耗的理論研究提供基礎,并為我國新型青貯添加劑的開發提供依據。
1.1 主要材料 本研究主要菌種為購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(agricultural culture collection of china,ACCC)的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,ACCC 11016)、戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici,ACCC 05481)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis,ACCC 19374)、黑曲霉(aspergillus niger,ACCC 30134)和綠色木霉(trichoderma viride,ACCC 30595)。購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri,CICC 20293)。 1.2 試驗設計 通過查閱關于添加同、異型發酵乳酸菌(LAB)發酵青貯玉米的相關文獻,初步確定兩類LAB 的添加量為1×105、3×105 和5×105 cfu·g-1 (即5、5.48、5.70 lg cfu·g-1),其中同型發酵乳酸菌為植物乳桿菌和戊糖片球菌等比例混合(菌種數量比為1∶1)的復合菌,異型發酵LAB為布氏乳桿菌。纖維素分解菌菌群的添加比例為,黑曲霉∶綠色木霉∶枯草芽孢桿菌分別為1∶1∶2、1∶2∶1和2∶1∶1,添加量分別為0.1、0.2和0.3％。然后進行響應曲面分析,優化各菌種比例和添加量。 1.3 指標測定及方法 將各個菌種復壯后,接種至選擇性培養基中擴繁,其中LAB采用MRS液體培養基[配方:酪蛋白胨10.0g,牛肉粉8.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖20.0g,硫酸鎂0.2g,乙酸鈉5.0g,檸檬酸二銨2.0g,磷酸氫二鉀2.0g,硫酸錳0.05g,吐溫801.0g,蒸餾水1L,pH (6.2±0.2)],真菌Aspergillus niger、Trichoderma viride采用PDA 液體培養基(配方:馬鈴薯提取液1L,葡萄糖20.0g,自然pH),bacillus subtilis采用LB培養基(配方:酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0g,氯化鈉10.0g,蒸餾水1L,pH7.0±0.2)。然后進行響應曲面優化,設計方法為BBD(Box-Behnken Design),本研究中響應值為LAB和真菌的數量,自變量分別為同型發酵LAB添加量、異型發酵LAB添加量、纖維素分解菌菌群比例和劑量,分別以A、B、C和D代表,每個自變量的3個試驗水平(低、中、高)編碼分別為-1、0、1(表1)。1試驗材料與方法
然后將各個擴繁后的菌液按照BBD 設計的添加比例和量進行混合,厭氧培養3d后(35℃,pH4.5)測定液體培養基中LAB和真菌的數量,具體采用傳統菌種計數法計數，每個梯度做3個重復。取菌落數在30~300的平板作為有效計數板,菌落以肉眼可見為準,每克鮮樣(FM)中微生物的數量,即菌落形成單位(cfu),計算方法為:
微生物數量＝菌落數×稀釋倍數×1000/涂布吸樣量。
1.4 數據統計分析
數據的初步整理和統計采用Microsoft Excel 2011軟件。采用DesignExpert軟件進行響應曲面優化,設通過最小二乘法擬合的二次多項式模型為:
式中:Y 為預測響應值,即LAB或真菌數量的預測值;xi 和xj 為自變量的編碼值,c0 為常數項,ai 為線性系數,bij 為二次項系數,n 為因子數(n ＝4)。按照BBD試驗設計的統計學要求對二次多項式中各試驗進行回歸擬合,擬合后獲得回歸方程,運用軟件中自帶功能,選取兩個預測值均為最大(Y1 為LAB,Y2 為真菌數量),以此得到最佳的各水平編碼值,最終計算求得各個變量的最佳組合。
2.1 模型建立與顯著性檢驗分析 采用BBD設計得到變量代碼,按照變量代碼進行試驗,結果測得LAB最大值為9.96 lg cfu·g-1,其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D);最小值為7.93 lg cfu·g-1,其代碼為-1(A)、0(B)、-1(C)、0(D),總體平均值為8.63 lg cfu·g-1,總體標準差(SD)為0.16,變異系數(CV)為1.89％.真菌測得最大值為5.23lgcfu·g-1,其代碼為0(A)、1(B)、0(C)、1(D);最小值為3.92lgcfu·g-1,其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D),總體平均值為4.49lgcfu·g-1,總體SD為0.27,CV 為6.05％(表2)。2結果與分析
利用DesignExpert軟件,將表2的Y1 和Y2 數據按二次多項式模型進行多元回歸擬合,獲得Y1 和Y2 對編碼自變量A、B、C和D的二次多項回歸方程(表3):
Y1 ＝8.56＋0.50A ＋0.50B ＋0.07C ＋0.04D ＋0.09A2＋0.11B2-0.01C2－2.58×10－3D2＋0.21AB ＋0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD＋0.08CD;
Y2＝4.38-0.02A -0.05B－8.33×10－3C＋0.32D－3.58×10－3A2 -0.04B2 -0.03C2＋0.35D2 -0.17AB＋0.30AC-0.01AD-0.18BC＋0.18BD-0.04CD。
通過對Y1、Y2 兩個模型的方差分析可知(表3),本研究所選用的二次多項式模型顯著性為:Y1,F＝17.23,P＜0.01;Y2,F＝2.83,P＝0.03.失擬項均不顯著(Y1:P＝0.50,Y2:P＝0.68).決定系數R2 分別為Y1＝0.95,Y2 ＝0.74.矯正決定系數R2adj 分別為Y1＝0.89,Y2＝0.48.顯著性檢驗結果表明(表3),Y1模型中試驗因素A 和B對LAB數量的曲面效應影響均極顯著(P＜0.01),因素A 和B的交互作用影響顯著(P＝0.02),其余因素及各因素間的交互作用影響均不顯著(P＞0.05).Y2 模型中僅試驗因素D、因素A 和B的交互作用對真菌數量的曲面效應影響顯著(P＜0.05),其余各因素及因素間的交互作用影響均不顯著(P＞0.05)。
2.2 復合發酵真菌和乳酸菌數量的響應
曲面分析通過對Y1 所繪制的響應曲面圖及等高線圖可知(圖1),A 和B兩個因素的交互對Y1 影響最大,當A和B的代碼越接近于1,Y1 的值越趨于最大值(9.96 lg cfu·g-1)。A 和C、D 因素的交互作用中,起主要作用的均為因素A.B和C、D因素的交互作用中,起主要作用的均為因素B.C和D兩個因素的交互對Y1 的值基本無影響(P ＝0.36)。總體來看,僅A 和B因素的交互作用影響顯著(P ＝0.02),其余兩因素的交互作用對Y1 的值影響均不大(P＞0.05)(表3)。通過對Y2 所繪制的響應曲面圖及等高線圖可知(圖2),對Y2 的值起主要作用的為因素D,且因素D 和其他因素的交互作用中因素D也也起到主要作用,但總體來看,除A、B因素交互作用外,其余各因素之間的交互作用對Y2 的值影響均不大(P ＞0.05)(表3)。最終利用軟件求出Y1 和Y2 均為最大值的代碼解(最優解)為A＝1.000,B＝0.853,C＝1.000,D＝0.996,將代碼解換算成實際自變量可得,同型發酵LAB添加量為5×105 cfu·g-1(5.70 lg cfu·g-1),異型發酵LAB 添加量為4.7×105 cfu·g-1 (5.67 lg cfu·g-1),纖維素分解菌比例為2∶1∶1,添加量為0.3％。
討 論
以往研究很少對多種類菌種的復合發酵進行研究,類似研究多在發酵堆肥中使用。本研究對LAB和纖維素分解菌復合發酵的發酵比例劑量進行了優化,而在實際發酵過程中,由于真菌和細菌的生長環境不同(好氧/厭氧)而在復合培養情況下僅能確定一種生長環境,因此本研究模擬青貯發酵初期的好養環境對復合菌種進行了優化,得到的結果能很好地為今后青貯復合發酵添加劑的開發提供理論方法。此外,由于多種菌劑的復合發酵體系比較復雜,本研究僅對其進行了初步的探索,因此還需要繼續開展實踐研究。 本研究對復合菌種發酵體系內的LAB數量進行優化,而未對傳統概念上認識的pH、乳酸或乙酸含量等發酵產物進行優化。其一方面原因為,LAB的代謝產物較多,產生情況較為復雜,且受發酵環境和底物的影響極大,而無論其代謝產物種類如何,其必然受自身數量的影響。另一方面,由于本研究中探究復合發酵體系,單純以某種LAB的代謝產物進行優化,并和真菌數量進行響應面分析,不能反映整體情況,且指標上不具有統一性。另外,選取多個LAB的多種代謝產物進行優化,其操作性較差,不易進行響應曲面優化。復合體系中將真菌數量作為另一個優化指標,其主要原因為本研究選取的能產生胞外酶的微生物,其產酶含量與數量呈顯著正相關關系,以數量為響應值即能很好的反映產酶的含量。 眾所周知,LAB有抑制真菌生長的特性,而本研究需要真菌在青貯玉米發酵初期發揮其產胞外酶的特性,因此對好氧情況下真菌和LAB均達到最大值的發酵條件進行了優化。研究發現,在確定的4個發酵條件中,同、異型發酵LAB的數量以及其交互作用對總體LAB數量影響最大(表3),且當兩類LAB數量最多時,總體LAB數量也最多,這與LAB生物學基礎理論相同。在發酵體系內加入的纖維素分解菌菌群的比例和劑量兩個因素對LAB數量無顯著影響(P ＞0.05),也進而證明了LAB數量并未受纖維素分解菌的抑制,這與諸多的研究結果相似,他們也都認為在厭氧條件下真菌不會抑制LAB 的生長。另外,本研究為多種類菌種的復合發酵,因此選用的培養條件不可能達到所有菌種最適的生長環境,且實際生產中青貯玉米的發酵環境也難于控制,所以本研究僅模擬了青貯發酵初期(3d內)的環境進行研究，這可能也是導致LAB生長不受真菌抑制的主要原因。本研究還發現,在確定的4個發酵條件中,影響真菌數量的主要因素為纖維素分解菌的添加劑量,且同、異型發酵LAB添加量的交互作用對真菌也有顯著影響(P＜0.05),而纖維素分解菌的添加比例對其無顯著影響(表3)(P＞0.05),由此也進一步證實了LAB對真菌的抑制作用。另外,纖維素分解菌的比例和添加量的交互作用中以添加量為主導,其添加量越高,真菌數量越高(圖2。這也說明了真菌添加劑量對其數量起到了決定性作用。值得注意的是,當纖維素分解菌的添加比例分別與同/異型發酵LAB添加量交互時,其產生了較大變異(圖2),這可能是不同種LAB抑制真菌的種類不同所致，其具體原因還有待進一步分析研究。除此之外,當纖維素分解菌的添加劑量分別與同/異質型LAB 添加量交互時,抑制真菌的效果異性發酵優于同型發酵(圖２),這表明異型發酵LAB產抑制真菌生長的乙酸含量高于同型發酵LAB。
結 論
1)LAB數量(Y1)和真菌數量(Y2)對編碼自變量A(同型發酵LAB 添加量)、B (異型發酵LAB 添加量)、C(纖維素分解菌比例)和D (纖維素分解菌添加劑量％)的二次多項回歸方程為: Y1＝8.56＋0.50A ＋0.50B ＋0.07C ＋0.04D ＋0.09A2＋0.11B2 －0.01C2 －2.58×10-3 D2 ＋0.21AB＋0.06AC －0.04AD －0.04BC －0.06BD ＋0.08CD ; Y2＝4.38－0.02A －0.05B －8.33×10-3C ＋0.32D－3.58×10-3A2 －0.04B2 －0.03C2 ＋0.35D2 －0.17AB＋0.30AC－0.01AD －0.18BC ＋0.18BD －0.04CD。 2)響應曲面分析法優化試驗條件結果為,同型發酵LAB添加量為5×105 cfu·g-1,異型發酵LAB添加量為4.7×105 cfu·g-1,纖維素分解菌比例黑曲霉∶綠色木霉菌∶枯草芽孢菌為2∶1∶1,添加量為0.3％。
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