隨著畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，飼用大豆需求量不斷攀升。但豆粕中存在致敏蛋白和多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，在一定程度上限制了其在飼料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用。在已知的38種大豆過(guò)敏原蛋白中，由α（58~77 kDα）、α' ( 58~83 kDa)和β（42~53 kDa）3個(gè)亞基組成的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)是免疫原性最強(qiáng)的大豆蛋白，約占大豆種子全蛋白含量的30%，會(huì)引起幼齡動(dòng)物如豬和牛等產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。

在豆粕飼料加工生產(chǎn)中，通過(guò)有效的加工來(lái)降低或消除大豆蛋白的抗原性至關(guān)重要。在這其中，β-伴大豆球蛋白中β亞基熱穩(wěn)定性和酶耐受性最強(qiáng)，不易在加工過(guò)程中完全去除。研究表明，現(xiàn)如今已開(kāi)發(fā)了多種加工方法和技術(shù)，例如熱處理，酶水解，發(fā)酵和糖化等，但熱處理時(shí)過(guò)度加熱會(huì)降低賴氨酸和其他必需氨基酸的消化性，其他常規(guī)處理也難以有效除去抗原蛋白。微生物發(fā)酵可以去除抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白，而不破壞豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分。同時(shí)，酶水解也是改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，降低其致敏性，改善其生化功能的有效方法。酶水解可以破壞蛋白質(zhì)肽鏈，產(chǎn)生分子量較低的肽或氨基酸，改變過(guò)敏原的線性和空間表位，從而降低蛋白質(zhì)的抗原性。枯草芽孢桿菌是一種常見(jiàn)的重要發(fā)酵劑，可產(chǎn)生各類酶，如堿性蛋白酶、淀粉酶等，利用枯草芽孢桿菌制備發(fā)酵豆粕，可將豆粕中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸和肽類等物質(zhì)，顯著降低致敏蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子。

如何準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)豆粕中抗原蛋白的含量目前仍然是個(gè)難題。這對(duì)于評(píng)價(jià)豆粕產(chǎn)品的功效和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要的意義，也是確定最佳豆粕發(fā)酵工藝的重要基礎(chǔ)。目前常見(jiàn)的蛋白檢測(cè)方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)、高效液相色譜法等。現(xiàn)有的β-伴大豆球蛋白的檢測(cè)技術(shù)的主要開(kāi)發(fā)思路以抗原免疫反應(yīng)為主，采用自制的兔抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，YOU等基于單克隆抗體6G4建立了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，檢出限為2.0 ng/mL。這些方法雖然在特異性、靈敏性方面各有優(yōu)勢(shì)，但均對(duì)分析條件有比較高的要求，抗體血清的制備比較復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)室差異無(wú)法保證重復(fù)性，很難實(shí)際應(yīng)用于豆粕樣品的快速檢測(cè)。近年來(lái)，靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)使適配體傳感器在分析方法中得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)室篩選能夠與β-伴大豆球蛋白β亞基特異性結(jié)合的核酸適配體，選用納米金(gold nanoparticles，AuNPs)作為比色探針，構(gòu)建了納米金適配體比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了β亞基的快速檢測(cè)，為發(fā)酵豆粕過(guò)程評(píng)價(jià)抗原蛋白含量奠定基礎(chǔ)。該傳感器在靈敏度和檢測(cè)效率方面具有優(yōu)異的性能，β亞基的檢測(cè)范圍為7~58 nmol/L，檢測(cè)限為2.58 nmol/L。其與ELISA檢測(cè)β-伴大豆球蛋白的回收率相似，并且省去制備血清的繁瑣步驟。

本研究旨在使用納米金適配體生物傳感器評(píng)估豆粕發(fā)酵過(guò)程中的抗原蛋白含量，以β-伴大豆球蛋白的降解率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化枯草芽孢桿菌等多種菌株、發(fā)酵方式、發(fā)酵酶等關(guān)鍵發(fā)酵條件，最終獲得豆粕發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，并結(jié)合SDS-PAGE方法對(duì)比驗(yàn)證傳感器檢測(cè)結(jié)果的正確性。研究將為豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解與高值化利用以及納米金適配體傳感器在豆粕發(fā)酵生產(chǎn)中評(píng)估致敏蛋白的應(yīng)用提供參考。

材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

枯草芽孢桿菌10071（CICC10071）、枯草芽孢桿菌20522（CICC20522）、副干酪乳桿菌DY2（CCTCC2017303）、植物乳桿菌DY6（CCTCC2017138），中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；釀酒酵母BY4741、植物乳桿菌DY1、干酪乳桿菌DY13，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2材料和設(shè)備

乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏、吐溫-80、檸檬酸三銨、葡萄糖、氯金酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、鹽酸、冰醋酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過(guò)硫酸銨、硫酸銨、亞硫酸氫鈉、堿性蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，豆粕，適配體的序列（5'-3'）。

多功能檢測(cè)儀，ST16R高速冷凍離心機(jī)，LF-Min-i4小型垂直電泳槽。

1.1.3培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基(g/L:牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，葡萄糖10.0，NaCI 5.0，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。

YPD培養(yǎng)基(g/L:酵母浸出粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，1×105Pa滅菌30 min。

MRS培養(yǎng)基(g/L:胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖20.0，K2HPO4 2.0，

檸檬酸三銨2.0，乙酸鈉5.0,  MgSO4·7H2O 0.58,  MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1 mL,  pH 6.3~6.5，1×105 Pa滅菌30 min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵菌株的選擇

將實(shí)驗(yàn)室保藏菌種按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到合適的培養(yǎng)基，在適宜培養(yǎng)溫度下活化24h，按照同樣的方式活化2~3代，繼續(xù)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌的菌液。

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的所列發(fā)酵菌株對(duì)數(shù)期的菌液混合均勻后置于無(wú)菌處理的自封袋中，同時(shí)以不添加菌液組為空白對(duì)照，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h。70℃烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.2發(fā)酵方式的優(yōu)化

選取優(yōu)化獲得最佳菌株，將其按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到培養(yǎng)基中，30℃活化24 h，按照同樣的方式活化2~3代，繼續(xù)培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液。

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的菌液以及堿性蛋白酶（200 U/g）混合均勻后置于無(wú)菌處理的自封袋中，分別做不添加菌液或蛋白酶的發(fā)酵組，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵60 h。70℃烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.3蛋白酶添加量的優(yōu)化

控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37℃發(fā)酵60 h，70℃下烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.4菌液接種量的優(yōu)化

控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37℃發(fā)酵60 h，70℃下烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.4菌液接種量的優(yōu)化

控制豆粕中的水、糖蜜及堿性蛋白酶的添加量不變，分別接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、5%、7%、 10%、20%、30%的菌液，30℃發(fā)酵60 h、70℃烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.5固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及7%的菌液以及堿性蛋白酶（200 U/g）混合均勻后置于無(wú)菌處理的自封袋中，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵12、24、36、48、60、72、84 h。70 ℃烘干、粉碎，測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.7 SDS-PAGE驗(yàn)證

將1.0 g豆粕樣品溶于15 mL裂解蛋白溶液(0.03 mol/L Tri-HC1，15 g/L SDS，0.1 mol/L亞硫酸鈉)，反應(yīng)2 h，12 000 r/min離心7 min后取上清液。采用10%聚丙烯酞胺分離凝膠進(jìn)行電泳。在電泳前，將上清液與樣品加載緩沖液(5X)在水浴下加熱10 min。轉(zhuǎn)移到每個(gè)孔中的蛋白質(zhì)分散體的量約為10 μL，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶。

1.2.8氨基酸含量檢測(cè)

稱取1.0 g豆粕于具塞試管中，加入質(zhì)量濃度為5%的三氯乙酸定容至25 mL，常溫超聲20 min后靜置2h，用雙層濾紙過(guò)濾。取1 mL澄清濾液，15 000 r/min離心30 min，上清液用0.22 μm水膜再次過(guò)濾，使用Agilent 1260氨基酸專用高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.2.9有機(jī)酸含量檢測(cè)

取1.0 g豆粕于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，漩渦振蕩15 min，10 000 r/min離心5min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行液相檢測(cè)。分析柱用有機(jī)酸柱(Aninex Hpx-87H ionexchange column)柱溫50℃，流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)樣及樣品每個(gè)跑27 min。根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積計(jì)算樣品中各種有機(jī)酸的含量。

結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵菌株的選擇

微生物發(fā)酵能有效消除豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子，并通過(guò)產(chǎn)生蛋白水解酶將豆粕中的大分子蛋白降解為易吸收的小分子蛋白，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。常見(jiàn)的豆粕發(fā)酵所用菌種包括枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母等。比較不同菌株固態(tài)發(fā)酵降解豆粕β-伴大豆球蛋白β亞基的效果，如圖1-a所示，固態(tài)發(fā)酵豆粕120 h后，枯草芽孢桿菌20522發(fā)酵的豆粕的蛋白降解率可達(dá)41.08%，其次是枯草芽孢桿菌10071，為34.86%。整體來(lái)看枯草芽孢桿菌在降解致敏蛋白方面的效果優(yōu)于釀酒酵母、植物乳桿菌等。同時(shí)，圖1-b的SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩組枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的β亞基條帶相對(duì)更淺，降解程度更高，而a亞基也部分降解。通過(guò)圖1-c目的蛋白條帶灰度的歸一化分析來(lái)看，枯草芽孢桿菌且尤其是20522菌株的目的蛋白占比最低，說(shuō)明其含量低、降解度更高，這與傳感器的檢測(cè)結(jié)果相似。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于不同菌種發(fā)酵豆粕的研究顯示，不同菌種降解抗原蛋白的效果與其最適生長(zhǎng)環(huán)境和分泌的蛋白酶有關(guān)，枯草芽孢桿菌往往在固態(tài)發(fā)酵條件下占據(jù)優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌中分離的堿性蛋白酶可使β-伴大豆球蛋白抗原性有效降低。枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶被歸類為絲氨酸肽酶，其水解位點(diǎn)是疏水氨基酸的碳末端，可通過(guò)破壞抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)和表位構(gòu)象，使其降低或失去與特異性抗體結(jié)合的能力。因此，選擇枯草芽孢桿菌20522作為最佳發(fā)酵菌。

2.2發(fā)酵方式優(yōu)化

菌發(fā)酵、酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵是常見(jiàn)的豆粕固態(tài)發(fā)酵方法。除了微生物發(fā)酵，添加外源酶也可以促進(jìn)大豆蛋白活性等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解。眾所周知，酶解不僅破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且對(duì)破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著作用。根據(jù)報(bào)道，酶水解脫脂大豆粉蛋白會(huì)降低其致敏性，最適合用于此目的的酶是堿性蛋白酶。但單純通過(guò)酶水解生產(chǎn)的小肽具有明顯苦味，生產(chǎn)成本高，限制了其開(kāi)發(fā)利用。

如圖2-a所示，菌酶協(xié)同組發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白β亞基的降解程度最高，可達(dá)51.35%，其次是酶發(fā)酵，降解率為45.61 %。而菌降解蛋白在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中效果一般，表明蛋白酶是影響發(fā)酵過(guò)程中蛋白降解的主要因素。從圖2-b的SDS-PAGE的驗(yàn)證結(jié)果可以看出，菌發(fā)酵的豆粕蛋白條帶比較完整，酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的蛋白條帶大部分已經(jīng)降解，通過(guò)圖2-c灰度分析的結(jié)果顯示，蛋白含量從小到大依次是菌酶協(xié)同發(fā)酵(0.38<酶發(fā)酵（0.43<菌發(fā)酵0.86），這與納米金適配體傳感器檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)基本吻合。據(jù)研究報(bào)道，菌酶協(xié)同發(fā)酵可以利用微生物分泌的酶系與外加酶共同作用處理豆粕，同時(shí)添加的蛋白酶大大提高了發(fā)酵培養(yǎng)基的整體蛋白酶活性，促進(jìn)了發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)、酶的分泌和糖的代謝，提高了發(fā)酵效率和質(zhì)量，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3酶添加量?jī)?yōu)化

發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶的活性主要受微生物分泌蛋白酶的量、pH值、微生物分泌的酶對(duì)蛋白酶的降解以及某些酶抑制成分等因素的影響。在菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝條件下，圖3-a中隨著堿性蛋白酶酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亞基的降解率呈上升趨勢(shì)。其中，50~200 U/g添加量間的降解效率提升最為明顯，在此區(qū)間內(nèi)酶解底物是過(guò)量的，加酶量越多，酶解反應(yīng)產(chǎn)物就越多。此后隨著酶添加量增加，降解程度變化較小，說(shuō)明酶解底物反應(yīng)趨于飽和，添加過(guò)多蛋白酶并沒(méi)有較好的降解效果，還會(huì)造成蛋白酶的浪費(fèi)。經(jīng)過(guò)60 h發(fā)酵，200 U/g酶添加量組豆粕β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)61.94%。SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果顯示，隨著酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亞基條帶逐漸變淺，當(dāng)酶量≥100 U/g時(shí)效果更為明顯。因此，選擇200 U/g作為堿性蛋白酶的最佳添加量。

2.4菌液量?jī)?yōu)化

由圖4可以看出，隨著枯草芽孢桿菌20522接種量的增加，發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)枯草芽孢桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，降解率最高達(dá)到62.78%；當(dāng)枯草芽孢桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在類似的枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的研究中，也存在隨著菌液接種量的增加，發(fā)酵豆粕肽含量先增加隨后下降的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)樾‰暮肯入S發(fā)酵降解蛋白而增加，隨后被又分解成更小的片段而導(dǎo)致出現(xiàn)下降。常見(jiàn)的豆粕發(fā)酵工藝中添加枯草芽孢桿菌菌液量大多在5%~15%。因此，選擇7%作為枯草芽孢桿菌20522菌液量的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。此外，在β-伴大豆球蛋白降解程度較高時(shí)，從SDS-PAGE的電泳圖難以觀察出各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差別，而納米金適配體傳感器的檢測(cè)結(jié)果則能夠清晰、靈敏的反映出各實(shí)驗(yàn)組豆粕的β-伴大豆球蛋白的降解率。

2.5固態(tài)發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

發(fā)酵過(guò)程包括微生物的生長(zhǎng)、代謝和物質(zhì)的降解。這一過(guò)程需要一定的時(shí)間，但過(guò)度延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致有害細(xì)菌污染和發(fā)酵成本增加等問(wèn)題。如圖5所示，在堿性蛋白酶加酶量200 U/g，枯草芽孢桿菌20522菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、料水比2:1（g/mL）、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30℃的條件下，發(fā)酵48 h~60 h，蛋白降解率有明顯提升。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加降解率趨于平穩(wěn)，在最佳發(fā)酵時(shí)間72 h時(shí)達(dá)到最高值75.27 %。根據(jù)菌酶協(xié)同發(fā)酵的相關(guān)研究，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，添加的蛋白酶和發(fā)酵菌株分泌的蛋白酶協(xié)同降解蛋白質(zhì)。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH逐漸降低，發(fā)酵微生物生長(zhǎng)緩慢，蛋白酶活性逐漸喪失，因此蛋白降解效率減慢。另一方面，抗原性下降的程度取決于抗原位點(diǎn)的破壞程度。發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白的抗原性在酶解后期略有增加而不是降低，是由于蛋白酶進(jìn)一步水解肽暴露了一些線性或隱性表位，或者抗原活性低的肽繼續(xù)水解成高活性的小片段。因此，菌酶協(xié)同發(fā)酵是降低致敏性的有效方法。

2.6豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)分析

2.6.1游離氨基酸含量

如圖6所示，經(jīng)過(guò)200 U/g堿性蛋白酶和7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的枯草芽孢桿菌協(xié)同發(fā)酵72 h，豆粕總游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.50%，提高了3.96倍。其中必需氨基酸關(guān)乎飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)劣，其含量為原來(lái)的9.25倍，整體增長(zhǎng)幅度較非必需氨基酸更為明顯，能有效地提高飼料蛋白質(zhì)的利用率。在發(fā)酵豆粕的必需氨基酸中，賴氨酸(lys)含量最高（0.37%），其次是亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)等，色氨酸(Trp)和半肽氨酸（Cys）含量最低。大部分氨基酸含量經(jīng)過(guò)發(fā)酵后均升高，尤其是Lys和蛋氨酸（Met）的含量分別為原來(lái)的17.27倍和7.73倍。Lys和Met是豬、雞飼料中最重要的2個(gè)限制性氨基酸，對(duì)家禽等的生長(zhǎng)發(fā)育及其他所有氨基酸的消化吸收均有關(guān)鍵影響。同時(shí)，據(jù)NISHIWAKI等報(bào)道，當(dāng)疏水性氨基酸含量高時(shí)，肽的苦味相當(dāng)強(qiáng)烈，而本研究中蛋白降解釋放疏水性氨基酸，如Val、 Leu、Phe和異亮氨酸CIle，有效消除了豆粕的苦味。另一方面，β-伴大豆球蛋白含有大量的谷氨酸（Glu），豆粕發(fā)酵后游離Glu的含量顯著提高2.55倍。這也證實(shí)了β-伴大豆球蛋白在菌酶協(xié)同發(fā)酵中確實(shí)發(fā)生了明顯的降解。YANG等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)氨基酸含量的提升相較于其他微生物中具有優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果表明，本研究的最優(yōu)發(fā)酵工藝對(duì)蛋白質(zhì)的降解效果顯著，氨基酸含量趨于營(yíng)養(yǎng)均衡，顯著提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.6.2有機(jī)酸含量

有機(jī)酸作為畜禽的飼料添加劑，可直接參與機(jī)體能量、結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)發(fā)酵后豆粕的保質(zhì)期。微生物發(fā)酵是產(chǎn)生有機(jī)酸的有效途徑，HENG等研究發(fā)現(xiàn)添加的蛋白酶能有效地促進(jìn)糖代謝，分泌更多的有機(jī)酸，引起的pH值下降還可以防止腐敗和病原微生物增殖。如圖7所示，經(jīng)過(guò)菌酶協(xié)同發(fā)酵處理后的發(fā)酵豆粕中各項(xiàng)有機(jī)酸指標(biāo)均有所提高。根據(jù)毛銀等研究，發(fā)酵豆粕中的酸譜根據(jù)發(fā)酵工藝的不同有較大的差別，主要以乳酸、乙酸和檸檬酸這3種有機(jī)酸為主。枯草芽孢桿菌和堿性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕中含量最高的是檸檬酸，由原來(lái)的2.68%提高到5.54%。乳酸也是衡量豆粕質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其具有維持動(dòng)物腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進(jìn)鈣質(zhì)的吸收等功能，豆粕經(jīng)過(guò)發(fā)酵后乳酸含量達(dá)到1.62%，提高了17.72倍。乙酸含量達(dá)到1.01%，其作為抗微生物劑、酸度調(diào)節(jié)劑和酸味劑，提高了飼料的適口性。除此之外，發(fā)酵還產(chǎn)生了丙酸和蘋(píng)果酸，含有多種有機(jī)酸的豆粕可以有效的抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)，提高機(jī)體的免疫力。

結(jié) 論

本研究利用新型納米金適配體傳感器從抗原蛋白降解的角度評(píng)價(jià)豆粕發(fā)酵過(guò)程。通過(guò)測(cè)定β-伴大豆球蛋白降解率，指導(dǎo)優(yōu)化枯草芽孢桿菌20522/堿性蛋白酶菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝，最終確定了最適發(fā)酵條件為:堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽孢桿菌20522菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、料水比2:1（g/mL）、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。該菌酶協(xié)同工藝在發(fā)酵豆粕降解致敏蛋白方面效果良好，β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)75 .27 %，此外氨基酸含量提高3.96倍，乳酸、檸檬酸、乙酸等有機(jī)酸的含量也有所上升，發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性得以顯著改善。同時(shí)，本研究驗(yàn)證了納米金適配體傳感器在評(píng)價(jià)豆粕抗原蛋白降解方面具有良好的特異性、穩(wěn)定性和適用性，為其在飼料行業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論參考及實(shí)踐指導(dǎo)。

活力99增香增甜飼料發(fā)酵劑，高濃度乳酸菌、酵母菌專業(yè)酶菌結(jié)合飼料發(fā)酵劑，多功能飼料發(fā)酵劑，青貯飼料發(fā)酵劑

本產(chǎn)品是一種以高濃度乳酸菌和酵母菌等組合酶菌結(jié)合的復(fù)合專業(yè)飼料發(fā)酵劑產(chǎn)品，可以發(fā)酵我們常見(jiàn)的大部分飼料原料、農(nóng)家飼料、農(nóng)產(chǎn)品與食品加工下腳料，制作活性EM菌液與制作青貯飼料，具有發(fā)酵、除霉、降解纖維、提高發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)與適口性且能夠長(zhǎng)時(shí)間保存等功能，具有操作簡(jiǎn)單成功率高、成本低廉等特點(diǎn)。

【原料組成】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌、米曲霉等，糖化酶與復(fù)合酶制劑與載體等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等合計(jì)≥100億cfu/g，水分＜9.0%。

凈重：200 克/袋。

本產(chǎn)品是在活力99生酵劑的基礎(chǔ)上的升級(jí)產(chǎn)品，升級(jí)了増香增甜等功能效果。

鑒別本產(chǎn)品真假與效果的簡(jiǎn)單方法：500毫升左右的礦泉水瓶子中放入約50克大米+300毫升35℃左右的溫水，加入本產(chǎn)品5克，幾個(gè)小時(shí)就會(huì)產(chǎn)生大量香醇?xì)怏w，72小時(shí)內(nèi)大米基本溶解為乳狀。做試驗(yàn)時(shí)請(qǐng)切記要注意礦泉水瓶炸開(kāi)的安全。

產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)

（一）制作加強(qiáng)型活性EM菌液

在非金屬容器中將本品1包（200克）與1公斤紅糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉類的飼料代替）放入約50公斤溫水中，簡(jiǎn)單密封48小時(shí)后就變成了加強(qiáng)型活性EM菌液（每毫升活菌在100億左右）。其使用方法如下：

1.在畜禽上的使用方法：根據(jù)不同動(dòng)物與飼養(yǎng)周期按其飼料重量的0.1%-0.5%拌入飼料或飲水中后飼喂或飲用。

2.養(yǎng)殖場(chǎng)緊急除臭生物消毒：取加強(qiáng)型活性EM菌液兌水30倍清水，對(duì)產(chǎn)生臭味與異味的養(yǎng)殖區(qū)域、糞污水道、糞堆、污水池進(jìn)行噴灑，以噴灑表面濕潤(rùn)為準(zhǔn)，接待參觀前1-3小時(shí)補(bǔ)噴一次效果更好。

3.制作青貯飼料：每噸青貯飼料中加入10公斤加強(qiáng)型活性EM菌液，簡(jiǎn)單噴灑在料上壓實(shí)密封發(fā)酵15天以上。

4.養(yǎng)殖水產(chǎn)上的使用：每畝使用5公斤加強(qiáng)型活性EM菌液進(jìn)行噴灑，晴天進(jìn)行噴灑后注意增氧。

（二）制作各種發(fā)酵飼料

本品能夠發(fā)酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、剩菜剩飯、米糠、統(tǒng)糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黃秸稈、牧草、紅薯藤、輕度霉變飼料等各種廉價(jià)飼料（下腳料）、各種飼料原料與全價(jià)飼料等，每500公斤待發(fā)酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加強(qiáng)型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉類的飼料原料、1公斤食鹽（含有足夠食鹽的原料就不添加），含水量調(diào)節(jié)到約60%，壓實(shí)密封發(fā)酵2-7天左右有濃郁香味時(shí)即可使用。發(fā)酵后飼料的適口性、營(yíng)養(yǎng)、消化率較未發(fā)酵前有明顯提升。發(fā)酵后的飼料根據(jù)不同動(dòng)物與不同飼養(yǎng)周期按照10%-50%與該動(dòng)物其它全價(jià)飼料混合后飼喂（先少量飼喂適應(yīng)后逐漸增加的原則），不可以單獨(dú)飼喂或全部飼喂發(fā)酵飼料。

（三）發(fā)酵水產(chǎn)動(dòng)物飼料成高濃度乳酸菌保健品

①部分發(fā)酵飼料運(yùn)用：100公斤水產(chǎn)飼料、50公斤清水、本品1包密封發(fā)酵7天以上變成高濃度乳酸菌發(fā)酵飼料，以10%比例與水產(chǎn)動(dòng)物飼料混合后飼喂，或者發(fā)酵飼料單獨(dú)飼喂；②全部發(fā)酵飼料飼喂：也叫輕度發(fā)酵飼料技術(shù)，300公斤水產(chǎn)全價(jià)飼料、本品1包、水120公斤混合發(fā)酵24小時(shí)全部飼喂，這種預(yù)消化結(jié)合大量乳酸菌飼喂能夠顯著改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康、水質(zhì)改善等優(yōu)點(diǎn)。

（四）發(fā)酵部分禽糞做飼料

發(fā)酵雞糞（鴿子糞、兔糞等）作豬、魚(yú)等動(dòng)物飼料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉類的飼料原料、500公斤雞糞，加入適量麥麩或米糠調(diào)節(jié)含水量約為55%-60%，覆蓋薄膜進(jìn)行發(fā)酵，一周左右有濃郁香味時(shí)即可使用，可代替飼料20%左右，用于喂豬或魚(yú)類等。

（五）發(fā)酵菜粕、棉粕、花生餅、茶枯脫毒

原料1000公斤，玉米面其它含淀粉類的飼料原料100公斤，食鹽2公斤，含水量調(diào)節(jié)到55%左右，本品2包，簡(jiǎn)單地?cái)嚢杈鶆颍芊獍l(fā)酵15天以上成為高濃度乳酸菌小肽豐富的生物蛋白飼料，喂前攤開(kāi)透氣10分鐘再作為蛋白質(zhì)原料使用于自配飼料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的發(fā)酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。

（六）中草藥及中藥渣發(fā)酵方法

1.固態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：將50公斤中草藥粉碎，越細(xì)越好放入40公斤的35℃左右的溫水中，加入玉米粉與豆粕各5公斤、本品1-2包、食鹽100克，放入塑料容器內(nèi)壓實(shí)密封發(fā)酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。

2.液態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：1公斤中草藥+1包本品+1公斤紅糖+20公斤清水混合在非金屬容器中簡(jiǎn)單密封發(fā)酵72小時(shí)以上后使用。每噸飼料中添加10公斤或每噸飲水中添加5公斤。

（七）直接拌料或飲水、制粒飼喂、制作水料

根據(jù)不同動(dòng)物在每噸飼料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2噸飲水中使用；本產(chǎn)品采用微生物多層包被技術(shù)，在每噸3包本品混合飼料中直接制粒，90℃下5分鐘不會(huì)影響效果；動(dòng)物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全價(jià)飼料、1000公斤清水混合后發(fā)酵6小時(shí)以上后飼喂（預(yù)消化的輕度發(fā)酵模式），24小時(shí)內(nèi)飼喂完。

廣西助農(nóng)畜牧科技有限公司有7個(gè)專業(yè)現(xiàn)代生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)實(shí)戰(zhàn)型團(tuán)隊(duì)，為全國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)的規(guī)劃、設(shè)計(jì)、建設(shè)、整改等服務(wù)；養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)保問(wèn)題解決方案（養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭、氨氣，蒼蠅、污水、糞便處理）與專業(yè)配套產(chǎn)品；提供全方位保姆式養(yǎng)殖技術(shù)與動(dòng)物診療服務(wù)（目前廣西區(qū)內(nèi)有一百多家中小養(yǎng)殖場(chǎng)的托管保姆）。 

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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長(zhǎng)行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能夠形成無(wú)抗養(yǎng)殖呢？其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長(zhǎng)、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個(gè)實(shí)施方案比你想象中效果更好，運(yùn)用的沒(méi)有不被效果折服的，值得嘗試驗(yàn)證

我們的技術(shù)僅需在出欄前半個(gè)月左右運(yùn)用益生菌+酶制劑+中草藥相關(guān)的無(wú)違禁安全產(chǎn)品，肉質(zhì)改善非常顯著，且可以批量化生產(chǎn)。

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